Ce studiază biologia moleculară. Biolog molecular de profesie. Stabilirea rolului genetic al acizilor nucleici

Progresele în studiul acizilor nucleici și al biosintezei proteinelor au condus la crearea unui număr de metode de mare importanță practică în medicină, agricultură și o serie de alte industrii.

După ce au fost studiate codul genetic și principiile de bază ale stocării și implementării informațiilor ereditare, dezvoltarea biologiei moleculare a ajuns într-un impas, deoarece nu existau metode care să facă posibilă manipularea genelor, izolarea și schimbarea acestora. Apariția acestor metode a avut loc în anii 1970-1980. Aceasta a dat un impuls puternic dezvoltării acestui domeniu al științei, care înflorește și astăzi. În primul rând, aceste metode vizează obținerea de gene individuale și introducerea lor în celulele altor organisme (clonarea moleculară și transgeneza, PCR), precum și metodele de determinare a secvenței nucleotidelor din gene (secvențierea ADN și ARN). Aceste metode vor fi discutate mai detaliat mai jos. Vom începe cu cea mai simplă metodă de bază, electroforeza, apoi vom trece la metode mai complexe.

ELECTROFOREZA ADN-ului

Este metoda de bază de lucru cu ADN, care este folosită împreună cu aproape toate celelalte metode pentru a izola moleculele dorite și a analiza rezultatele. Electroforeza pe gel este utilizată pentru a separa fragmentele de ADN după lungime. ADN-ul este un acid, moleculele sale conțin reziduuri de acid fosforic, care desprind un proton și capătă o sarcină negativă (Fig. 1).

Prin urmare, într-un câmp electric, moleculele de ADN se deplasează spre anod - un electrod încărcat pozitiv. Acest lucru se întâmplă într-o soluție de electrolit care conține ioni purtători de sarcină, datorită cărora această soluție conduce curentul. Pentru a separa fragmentele, se folosește un gel dens din polimeri (agaroză sau poliacrilamidă). Moleculele de ADN se „încurcă” în ea cu atât mai mult, cu atât sunt mai lungi și, prin urmare, cele mai lungi molecule se mișcă cel mai încet, iar cele mai scurte - cel mai rapid (Fig. 2). Înainte sau după electroforeză, gelul este tratat cu coloranți care se leagă de ADN și fluoresc în lumină ultravioletă și se obține un model de benzi în gel (vezi Fig. 3). Pentru a determina lungimile fragmentelor de ADN dintr-o probă, acestea sunt comparate cu un marker, adică un set de fragmente de lungimi standard depuse în paralel pe același gel (Fig. 4).

Cele mai importante instrumente pentru lucrul cu ADN-ul sunt enzimele care efectuează transformări ADN-ului în celulele vii: ADN polimeraze, ADN ligaze și endonucleaze de restricție sau enzime de restricție. ADN polimeraza Se realizează sinteza șablonului ADN, care permite propagarea ADN-ului într-o eprubetă. ADN ligaze coase moleculele de ADN împreună sau vindecă golurile din ele. Endonucleaze de restricție, sau restrictaze, tăiați moleculele de ADN în funcție de secvențe strict definite, ceea ce vă permite să decupați fragmente individuale din masa totală de ADN. Aceste fragmente pot conține în unele cazuri gene individuale.

restrictaze

Secvențele recunoscute de enzimele de restricție sunt simetrice, iar rupturile pot apărea la mijlocul unei astfel de secvențe sau cu o deplasare (în același loc în ambele catene de ADN). Schema de actiune tipuri diferite restrictaza este prezentată în fig. 1. În primul caz se obțin așa-numitele capete „tocite”, iar în al doilea - capete „lipioase”. În cazul capetelor „lipicioase” ale fundului, lanțul este mai scurt decât celălalt, se formează o secțiune monocatenară cu o secvență simetrică care este aceeași la ambele capete formate.

Secvențele finale vor fi aceleași atunci când orice ADN este scindat cu o enzimă de restricție dată și pot fi reunite deoarece au secvențe complementare. Pot fi ligați cu ADN ligază pentru a forma o singură moleculă. Astfel, este posibil să combinați fragmente din două ADN diferite și să obțineți așa-numitul ADN recombinat. Această abordare este utilizată în metoda clonării moleculare, care face posibilă obținerea de gene individuale și introducerea lor în celule care pot forma proteina codificată în genă.

clonarea moleculară

Clonarea moleculară folosește două molecule de ADN - o inserție care conține gena de interes și vector- ADN care acționează ca purtător. Insertul este „cusut” in vector cu ajutorul enzimelor, obtinandu-se o noua molecula de ADN recombinant, apoi aceasta molecula este introdusa in celulele gazda, iar aceste celule formeaza colonii pe un mediu nutritiv. O colonie este descendentul unei celule, adică o clonă, toate celulele coloniei sunt identice genetic și conțin același ADN recombinant. De aici și termenul de „clonare moleculară”, adică obținerea unei clone de celule care conține un fragment de ADN de interes pentru noi. După ce sunt obținute coloniile care conțin insertul care ne interesează, este posibil să se caracterizeze acest insert prin diferite metode, de exemplu, pentru a determina secvența exactă a acestuia. Celulele pot produce, de asemenea, proteina codificată de insert dacă aceasta conține o genă funcțională.

Când o moleculă recombinantă este introdusă în celule, are loc transformarea genetică a acestor celule. Transformare- procesul de absorbție de către o celulă a unui organism a unei molecule de ADN liber din mediu și integrarea acesteia în genom, ceea ce duce la apariția într-o astfel de celulă de noi trăsături ereditare pentru aceasta, caracteristice organismului-donator de ADN . De exemplu, dacă molecula introdusă conține o genă de rezistență la antibioticul ampicilină, atunci bacteriile transformate vor crește în prezența acesteia. Înainte de transformare, ampicilina le-a provocat moartea, adică un nou semn apare în celulele transformate.

VECTORI

Un vector trebuie să aibă un număr de proprietăți:

În primul rând, este o moleculă de ADN relativ mică, care poate fi manipulată cu ușurință.

În al doilea rând, pentru ca ADN-ul să fie conservat și reprodus într-o celulă, acesta trebuie să conțină o anumită secvență care să îi asigure replicarea (originea replicării, sau originea replicării).

În al treilea rând, trebuie să conțină gena marker, care asigură selecția doar a acelor celule în care a intrat vectorul. De obicei, acestea sunt gene de rezistență la antibiotice - apoi, în prezența unui antibiotic, toate celulele care nu conțin vectorul mor.

Clonarea genelor se realizează cel mai adesea în celulele bacteriene, deoarece acestea sunt ușor de cultivat și se înmulțesc rapid. Într-o celulă bacteriană, există de obicei o moleculă circulară mare de ADN, lungă de câteva milioane de perechi de baze, care conține toate genele necesare bacteriilor - cromozomul bacterian. Pe lângă aceasta, în unele bacterii există mici (câteva mii de perechi de baze) ADN circular, numit plasmide(Fig. 2). Ele, ca și ADN-ul principal, conțin o secvență de nucleotide care oferă capacitatea ADN-ului de a se replica (ori). Plasmidele se replic independent de ADN-ul principal (cromozomial), prin urmare sunt prezente în celulă într-un număr mare de copii. Multe dintre aceste plasmide poartă gene de rezistență la antibiotice, ceea ce face posibilă distingerea celulelor care poartă plasmida de celulele normale. Mai frecvent, sunt utilizate plasmide care poartă două gene care conferă rezistență la două antibiotice, cum ar fi tetraciclina și amicilina. Exista metode simple izolarea unui astfel de ADN plasmidic liber de ADN-ul cromozomului principal al bacteriei.

SEMNIFICAȚIA TRANSGENEZEI

Se numește transferul de gene de la un organism la altul transgenezași astfel de organisme modificate - transgenic. Metoda de transfer de gene în celulele microbiene este utilizată pentru a obține preparate de proteine ​​recombinante pentru medicină, în special, proteine ​​umane care nu provoacă respingere imună - interferoni, insulină și alți hormoni proteici, factori de creștere celulară, precum și proteine ​​pentru producerea de vaccinuri. În cazuri mai complexe, când modificarea proteinelor este efectuată corect numai în celulele eucariote, se folosesc culturi de celule transgenice sau animale transgenice, în special animale (în primul rând capre), care secretă proteinele necesare în lapte sau proteinele sunt izolate din sângele lor. . Așa se obțin anticorpii, factorii de coagulare a sângelui și alte proteine. obţinut prin transgeneză plante cultivate care sunt rezistente la erbicide și dăunători și au alte proprietăți benefice. Folosind microorganisme transgenice pentru a purifica apele uzate și a lupta împotriva poluării, există chiar și microbi transgenici care pot descompune petrolul. În plus, tehnologiile transgenice sunt indispensabile în cercetare științifică- dezvoltarea biologiei de astăzi este de neconceput fără utilizarea de rutină a metodelor de modificare și transfer de gene.

tehnologie de clonare moleculară

inserții

Pentru a obține o genă individuală din orice organism, tot ADN-ul cromozomial este izolat din acesta și scindat cu una sau două enzime de restricție. Enzimele sunt selectate astfel încât să nu taie gena care ne interesează, ci să facă rupturi de-a lungul marginilor ei, iar în ADN-ul plasmidic să facă o ruptură într-una dintre genele de rezistență, de exemplu, la ampicilină.

Procesul de clonare moleculară include următorii pași:

Tăiere și cusătură - construcția unei singure molecule recombinante dintr-o inserție și un vector.

Transformarea este introducerea unei molecule recombinante în celule.

Selecție - selecție de celule care au primit un vector cu o inserție.

taierea si cusatura

ADN-ul plasmidic este tratat cu aceleași enzime de restricție și se transformă într-o moleculă liniară dacă este selectată o astfel de enzimă de restricție care introduce 1 ruptură în plasmidă. Ca urmare, aceleași capete lipicioase apar la capetele tuturor fragmentelor de ADN rezultate. Pe măsură ce temperatura scade, aceste capete se unesc aleatoriu și sunt legate cu ADN ligază (vezi Fig. 3).

Se obține un amestec de ADN-uri circulare de compoziție diferită: unele dintre ele vor conține o anumită secvență de ADN cromozomială conectată la ADN-ul bacterian, altele vor conține fragmente de ADN cromozomial unite, iar altele vor conține o plasmidă circulară redusă sau dimerul acesteia. (Fig. 4).

transformare

Apoi, acest amestec este efectuat transformare genetică bacterii care nu contin plasmide. Transformare- procesul de absorbție de către o celulă a unui organism a unei molecule de ADN liber din mediu și integrarea acesteia în genom, ceea ce duce la apariția într-o astfel de celulă de noi trăsături ereditare pentru aceasta, caracteristice organismului-donator de ADN . Doar o plasmidă poate intra și se poate multiplica în fiecare celulă. Astfel de celule sunt plasate pe un mediu nutritiv solid care conține antibioticul tetraciclină. Celulele care nu au primit plasmida nu vor crește pe acest mediu, iar celulele care poartă plasmida formează colonii, fiecare dintre acestea conținând descendenții unei singure celule, adică. toate celulele dintr-o colonie poartă aceeași plasmidă (vezi Fig. 5).

Selecţie

În continuare, sarcina este de a izola numai celulele în care a intrat vectorul cu inserția și de a le distinge de celulele care poartă doar vectorul fără inserție sau care nu poartă vectorul deloc. Acest proces de selectare a celulelor potrivite este numit selecţie. Pentru aceasta, aplicați markeri selectivi- de obicei gene de rezistență la antibiotice în vector, și medii selective care conțin antibiotice sau alte substanțe selective.

În exemplul pe care îl luăm în considerare, celulele din coloniile crescute în prezența ampicilinei sunt subcultivate pe două medii: primul conține ampicilină, iar al doilea conține tetraciclină. Coloniile care conțin doar plasmida vor crește pe ambele medii, în timp ce coloniile care conțin ADN cromozomial inserat în plasmide nu vor crește pe mediul cu tetraciclină (Fig. 5). Dintre acestea, cele care conțin gena care ne interesează sunt selectate prin metode speciale, crescute în cantități suficiente, iar ADN-ul plasmidic este izolat. Din aceasta, folosind aceleași restrictaze care au fost folosite pentru a obține ADN recombinant, gena individuală de interes este tăiată. ADN-ul acestei gene poate fi folosit pentru a determina secvența de nucleotide, poate fi introdus în orice organism pentru a obține noi proprietăți sau pentru a sintetiza proteina dorită. Această metodă de izolare a genelor se numește clonarea moleculară.

PROTEINE FLUORESCENTE

Este foarte convenabil să folosiți proteine ​​fluorescente ca gene marker în studiile organismelor eucariote. Gena pentru prima proteină fluorescentă, proteină verde fluorescentă (GFP) a fost izolat din meduza Aqeuorea victoria și introdus în diferite organisme model (vezi Fig. 6) În 2008, O. Shimomura, M. Chalfi și R. Tsien au primit Premiul Nobel pentru descoperirea și aplicarea acestei proteine.

Apoi au fost izolate genele pentru alte proteine ​​fluorescente - roșu, albastru, galben. Aceste gene au fost modificate artificial pentru a produce proteine ​​cu proprietățile dorite. Diversitatea proteinelor fluorescente este prezentată în fig. 7, care prezintă o placă Petri cu bacterii care conțin gene pentru diferite proteine ​​fluorescente.

aplicarea proteinelor fluorescente

Gena proteinei fluorescente poate fi fuzionată cu gena oricărei alte proteine, apoi în timpul translației se va forma o singură proteină - o proteină de fuziune translațională sau fuziune(proteina de fuziune), care are fluorescență. Astfel, este posibil să se studieze, de exemplu, localizarea (locația) oricăror proteine ​​de interes în celulă, mișcarea acestora. Exprimând proteine ​​fluorescente numai în anumite tipuri de celule, este posibil să se eticheteze celulele de aceste tipuri în organism pluricelular(vezi Fig. 8 - creierul de șoarece, în care neuronii individuali au culori diferite datorită unei anumite combinații de gene proteice fluorescente). Proteinele fluorescente sunt un instrument indispensabil în biologia moleculară modernă.

PCR

O altă metodă de obținere a genelor se numește reacția în lanț a polimerazei (PCR). Se bazează pe capacitatea ADN polimerazelor de a completa a doua catenă de ADN de-a lungul catenei complementare, așa cum se întâmplă în celule în timpul replicării ADN-ului.

Originile replicării în această metodă sunt date de două bucăți mici de ADN numite seminte, sau grunduri. Acești primeri sunt complementari capetelor genei de interes de pe două catene de ADN. În primul rând, ADN-ul cromozomial din care urmează să fie izolată gena este amestecat cu semințe și încălzit la 99 ° C. Acest lucru duce la ruperea legăturilor de hidrogen și la divergența catenelor de ADN. După aceea, temperatura este coborâtă la 50-70 aproximativ C (în funcție de lungimea și succesiunea semințelor). În aceste condiții, primerii sunt atașați de regiuni complementare ale ADN-ului cromozomial, formând o dublă helix regulată (vezi Fig. 9). După aceea, se adaugă un amestec din toate cele patru nucleotide necesare pentru sinteza ADN-ului și ADN polimeraza. Enzima alungește primerii prin construirea de ADN dublu catenar din punctul de atașare a primerilor, adică. de la capetele unei gene până la capătul unei molecule de cromozom monocatenar.

Dacă amestecul este acum încălzit din nou, lanțurile cromozomiale și cele nou sintetizate se vor dispersa. După răcire, li se vor alătura din nou semințele, care sunt luate în exces mare (vezi Fig. 10).

Pe lanțurile nou sintetizate, acestea se vor uni nu la capătul de la care a început prima sinteză, ci la cel opus, deoarece lanțurile de ADN sunt antiparalele. Prin urmare, în al doilea ciclu de sinteză, numai secvența corespunzătoare genei va fi completată pe astfel de lanțuri (vezi Fig. 11).

Această metodă utilizează ADN polimeraza din bacterii termofile care pot rezista la fierbere și funcționează la temperaturi de 70-80 ° C, nu trebuie adăugată de fiecare dată, dar este suficient să o adăugați la începutul experimentului. Repetând procedurile de încălzire și răcire în aceeași secvență, putem dubla numărul de secvențe din fiecare ciclu, delimitat la ambele capete de semințele introduse (vezi Fig. 12).

După aproximativ 25 de astfel de cicluri, numărul de copii ale genei va crește de peste un milion de ori. Astfel de cantități pot fi ușor separate de ADN-ul cromozomial introdus în eprubetă și utilizate în diverse scopuri.

Secvențierea ADN-ului

O altă realizare importantă este dezvoltarea metodelor de determinare a secvenței nucleotidelor din ADN - Secvențierea ADN-ului(din engleză sequence - sequence). Pentru a face acest lucru, este necesar să obțineți gene pure din alt ADN folosind una dintre metodele descrise. Apoi lanțurile de ADN sunt separate prin încălzire și li se adaugă un primer marcat cu fosfor radioactiv sau o etichetă fluorescentă. Vă rugăm să rețineți că se ia o sămânță, complementară unui lanț. Apoi se adaugă ADN polimeraza și un amestec de 4 nucleotide. Un astfel de amestec este împărțit în 4 părți și la fiecare se adaugă una dintre nucleotide, modificată astfel încât să nu conțină o grupare hidroxil pe al treilea atom de deoxiriboză. Dacă o astfel de nucleotidă este inclusă în lanțul de ADN sintetizat, atunci alungirea sa nu va putea continua, deoarece polimeraza nu va avea de unde să atașeze următoarea nucleotidă. Prin urmare, sinteza ADN-ului după includerea unei astfel de nucleotide este întreruptă. Aceste nucleotide, numite dideoxinucleotide, sunt adăugate mult mai puțin decât de obicei, astfel încât terminarea lanțului are loc doar ocazional și în fiecare lanț în locuri diferite. Rezultatul este un amestec de lanțuri de lungimi diferite, fiecare având aceeași nucleotidă la capăt. Astfel, lungimea lanțului corespunde numărului de nucleotide din secvența studiată, de exemplu, dacă am avut o adenil dideoxinucleotidă, iar lanțurile rezultate aveau lungimea de 2, 7 și 12 nucleotide, atunci adenina se afla în pozițiile a doua, a șaptea și a douăsprezecea în gena. Amestecul rezultat de lanțuri poate fi ușor separat după dimensiune folosind electroforeză, iar lanțurile sintetizate pot fi identificate prin radioactivitate pe film cu raze X (vezi Fig. 10).

Se pare că imaginea din partea de jos a imaginii, numită radioautograf. Deplasându-ne de jos în sus și citind litera de deasupra coloanelor fiecărei zone, vom obține secvența de nucleotide prezentată în figura din dreapta autografului. S-a dovedit că sinteza este oprită nu numai de dideoxinucleotide, ci și de nucleotide în care o grupare chimică, de exemplu, un colorant fluorescent, este atașată la a treia poziție a zahărului. Dacă fiecare nucleotidă este marcată cu propriul colorant, atunci zonele obținute prin separarea lanțurilor sintetizate vor străluci cu o lumină diferită. Acest lucru face posibilă efectuarea reacției într-o eprubetă simultan pentru toate nucleotidele și, prin separarea lanțurilor rezultate după lungime, identificarea nucleotidelor după culoare (vezi Fig. 11).

Astfel de metode au făcut posibilă determinarea secvențelor nu numai ale genelor individuale, ci și citirea genomilor întregi. Au fost dezvoltate acum metode și mai rapide pentru determinarea secvențelor de nucleotide din gene. Dacă primul genom uman a fost descifrat de un mare consorțiu internațional folosind prima metodă dată în 12 ani, a doua, folosind a doua, în trei ani, acum acest lucru se poate face într-o lună. Acest lucru vă permite să preziceți predispoziția unei persoane la multe boli și să luați măsuri în avans pentru a le evita.

Dezvoltarea biochimiei, biofizicii, geneticii, citochimiei, multor secțiuni de microbiologie și virologie pe la începutul anilor 40 ai secolului XX. a condus îndeaproape la studiul fenomenelor vieţii la nivel molecular. Succesele obținute de aceste științe, simultan și din diferite părți, au condus la conștientizarea faptului că tocmai la nivel molecular funcționează principalele sisteme de control ale organismului și că progresul în continuare al acestor științe va depinde de dezvăluire. functii biologice moleculele care alcătuiesc corpurile organismelor, participarea lor la sinteza și degradarea, transformările reciproce și reproducerea compușilor în celulă, precum și schimbul de energie și informații care are loc în acest caz. Astfel, la joncțiunea acestor discipline biologice cu chimia și fizica, a apărut o ramură complet nouă - biologia moleculară.

Spre deosebire de biochimie, atenția biologiei moleculare moderne se concentrează în principal pe studiul structurii și funcției celor mai importante clase de biopolimeri - proteine ​​și acizi nucleici, dintre care primul determină însăși posibilitatea reacțiilor metabolice, iar al doilea - biosinteza unor proteine ​​specifice. Prin urmare, este clar că este imposibil să se facă o distincție clară între biologia moleculară și biochimie, ramurile corespunzătoare ale geneticii, microbiologiei și virologiei.

Apariția biologiei moleculare a fost strâns asociată cu dezvoltarea de noi metode de cercetare, care au fost deja discutate în capitolele relevante. Odată cu dezvoltarea microscopiei electronice și a altor metode de tehnică microscopică, metodele de fracționare a elementelor celulare dezvoltate în anii 1950 au jucat un rol important. Acestea s-au bazat pe metode îmbunătățite de centrifugare diferențială (A. Claude, 1954). În acest moment, existau deja metode destul de fiabile pentru izolarea și fracționarea biopolimerilor. Aceasta include, în special, pe cea propusă de A. Tiselius (1937; Premiul Nobel, 1948) metoda de fracţionare a proteinelor prin electroforeză, metode de izolare şi purificare a acizilor nucleici (E. Kay, A. Downs, M. Sevag, A. Mirsky etc.). În același timp, în multe laboratoare ale lumii au fost dezvoltate diverse metode de analiză cromatografică (A. Martin și R. Sing, 1941; Premiul Nobel, 1952), ulterior îmbunătățite semnificativ.

Analiza difracției cu raze X a jucat un serviciu neprețuit în descifrarea structurii biopolimerilor. Principiile de bază ale analizei difracției cu raze X au fost dezvoltate la King's College London University sub conducerea lui W. Bragg de un grup de cercetători, care a inclus J. Bernal, A. Londsdale, W. Astbury, J. Robertson și alții.

De remarcat este cercetarea profesorului Moskovsky universitate de stat A. R. Kizel despre biochimia protoplasmei (1925 - 1929), care au avut o mare importanță pentru formarea ulterioară a biologiei moleculare. Kizel a dat o lovitură noțiunii bine înrădăcinate că orice protoplasmă se bazează pe un corp proteic special - plăci, care se presupune că determină toate caracteristicile sale structurale și funcționale cele mai importante. El a arătat că plăcile sunt o proteină care se găsește doar în mixomicete, și apoi într-un anumit stadiu de dezvoltare și că nicio componentă permanentă - o singură proteină scheletică - nu există în protoplasmă. Astfel, s-a ajuns la studiul problemei structurii protoplasmei și al rolului funcțional al proteinelor calea cea bunași a avut loc pentru dezvoltarea lui. Cercetările lui Kisel au câștigat recunoaștere la nivel mondial, stimulând studiul chimiei părțile constitutive celule.

Termenul de „biologie moleculară”, folosit pentru prima dată de cristalograful englez profesor al Universității din Leeds W. Astbury, a apărut probabil la începutul anilor 1940 (înainte de 1945). Studiile fundamentale de difracție cu raze X ale proteinelor și ADN-ului, efectuate de Astbury în anii 1930, au servit drept bază pentru descifrarea ulterioară cu succes a structurii secundare a acestor biopolimeri. În 1963, J. Bernal scria: „Un monument lui va fi ridicat de către întreaga biologie moleculară - știința pe care a numit-o și a fondat-o cu adevărat” * , În literatură, acest termen a apărut pentru prima dată, poate, în 1946. în articolul lui W. Astbury „Progress of X-ray Diffraction analysis of organic and fibrillar compounds”, publicat în revista engleză „Nature” ** . În Harvey Lecture, Astbury (1950) a remarcat: „Sunt mulțumit că termenul de biologie moleculară este acum destul de utilizat, deși este puțin probabil să fi fost primul care l-a propus. Mi-a plăcut și am încercat de mult să îl răspândesc. ” ***. Deja în 1950, Astbury era clar că biologia moleculară se ocupă în primul rând de structura și conformația macromoleculelor, al căror studiu este de o importanță decisivă pentru înțelegerea funcționării organismelor vii.

* (biogr. Mem. Colegii Roy. Soc, 1963, v. 9, 29.)

** (W. T. Astbury. Progresul analizei cu raze X a structurilor organice și fibrelor.- Natura,. 1946, v. 157, 121.)

*** (W. T. Astbury. Aventuri în Biologie moleculara. Thomas Springfield, 1952, p. 3.)

Biologia moleculară s-a confruntat și se confruntă, de fapt, cu aceleași sarcini ca și biologia în ansamblu - cunoașterea esenței vieții și a fenomenelor sale de bază, în special, cum ar fi ereditatea și variabilitatea. Biologia moleculară modernă are scopul în primul rând de a descifra structura și funcția genelor, modalitățile și mecanismele de implementare. informația genetică organisme aflate în diferite stadii ale ontogenezei și în diferite etape ale citirii acesteia. Este conceput pentru a dezvălui mecanismele subtile de reglare a activității genelor și diferențierea celulelor, pentru a elucida natura mutagenezei și baza moleculară a procesului evolutiv.

Stabilirea rolului genetic al acizilor nucleici

Pentru dezvoltarea biologiei moleculare cea mai mare valoare a avut următoarele descoperiri. În 1944, cercetătorii americani O. Avery, K. McLeod (Premiul Nobel, 1923) și M. McCarthy au arătat că moleculele de ADN izolate din pneumococi au activitate de transformare. După hidroliza acestor ADN-uri de către dezoxiribonuclează, activitatea lor transformatoare a dispărut complet. Astfel, pentru prima dată, s-a dovedit în mod convingător că ADN-ul, și nu proteina, este înzestrat cu funcții genetice într-o celulă.

Pentru dreptate, trebuie remarcat faptul că fenomenul de transformare bacteriană a fost descoperit mult mai devreme decât descoperirea lui Avery, McLeod și McCarthy. În 1928, F. Griffith a publicat un articol în care a raportat că, după adăugarea celulelor ucise ale unei tulpini virulente încapsulate la pneumococi nevirulenți (neîncapsulați), amestecul de celule rezultat devine fatal pentru șoareci. Mai mult, celulele pneumococice vii izolate de la animalele infectate cu acest amestec erau deja virulente și posedau o capsulă polizaharidă. Astfel, în acest experiment, s-a demonstrat că sub influența unor componente ale celulelor pneumococice ucise, forma neîncapsulată a bacteriilor se transformă într-o formă virulentă care formează capsule. Șaisprezece ani mai târziu, Avery, McLeod și McCarthy au înlocuit celulele pneumococice întregi ucise cu acidul lor dezoxiribonucleic în acest experiment și au arătat că ADN-ul era cel care avea activitate de transformare (vezi și capitolele 7 și 25). Semnificația acestei descoperiri este greu de supraestimat. A stimulat studiul acizilor nucleici în multe laboratoare din întreaga lume și a forțat oamenii de știință să se concentreze pe ADN.

Odată cu descoperirea lui Avery, McLeod și McCarthy, la începutul anilor 50, destul de mulți un numar mare de dovezi directe și indirecte că acizii nucleici joacă un rol excepțional în viață și poartă o funcție genetică. Acest lucru, în special, a fost indicat de natura localizării ADN-ului în celulă și de datele lui R. Vendrelli (1948) că conținutul de ADN per celulă este strict constant și se corelează cu gradul de ploidie: în celulele germinale haploide, ADN-ul este jumătate decât în ​​celulele somatice diploide. Stabilitatea metabolică pronunțată a ADN-ului a mărturisit și în favoarea rolului genetic al ADN-ului. Până la începutul anilor 1950, s-au acumulat o mulțime de fapte diverse, care indică faptul că majoritatea factorilor mutageni cunoscuți acționează în principal asupra acizilor nucleici și, în special, asupra ADN-ului (R. Hotchkiss, 1949; G. Ephrussi-Taylor, 1951; E. Freese, 1957 și alții).

De o importanță deosebită în stabilirea rolului genetic al acizilor nucleici a fost studiul diferiților fagi și virusuri. În 1933, D. Schlesinger a găsit ADN în bacteriofagul Escherichia coli. De la izolarea virusului mozaic al tutunului (TMV) în stare cristalină de către W. Stanley (1935, Premiul Nobel, 1946), a început o nouă etapă în studiul virusurilor plantelor. În 1937-1938. angajații Stației Agricole Rothamsted (Anglia) F. Bowden și N. Peary au arătat că multe virusuri ale plantelor izolate de aceștia nu sunt globuline, ci sunt ribonucleoproteine ​​și conțin acid nucleic ca componentă obligatorie. La începutul anilor '40, au fost publicate lucrările lui G. Schramm (1940), P. A. Agatov (1941), G. Miller și W. Stanley (1941), care indică faptul că o modificare chimică notabilă a componentei proteice nu conduce la pierderea infectiositatii TMV. Acest lucru a indicat că componenta proteică nu ar putea fi un purtător proprietăți ereditare virus, așa cum au continuat să creadă mulți microbiologi. Dovezi convingătoare în favoarea rolului genetic al acidului nucleic (ARN) în virusurile plantelor au fost obținute în 1956 de G. Schramm în Tübingen (RFA) și H. Frenkel-Konrath în California (SUA). Acești cercetători au izolat aproape simultan și independent unul de celălalt ARN-ul din TMV și au arătat că acesta, și nu proteina, are infecțiozitate: ca urmare a infecției plantelor de tutun cu acest ARN, s-au format și s-au înmulțit particule virale normale în ele. Aceasta a însemnat că ARN-ul conținea informații pentru sinteza și asamblarea tuturor componentelor virale, inclusiv a proteinei virale. În 1968, I. G. Atabekov a stabilit că proteina joacă un rol semnificativ în însăși infecția plantelor - natura proteinei determină spectrul plantelor gazdă.

În 1957, Frenkel-Konrat a efectuat pentru prima dată reconstrucția TMV din componentele sale constitutive - ARN și proteine. Alături de particulele normale, el a primit „hibrizi” amestecați în care ARN-ul era de la o tulpină și proteina de la alta. Ereditatea unor astfel de hibrizi a fost complet determinată de ARN, iar descendența virusurilor a aparținut tulpinii al cărei ARN a fost folosit pentru a obține particulele mixte inițiale. Mai târziu, experimentele lui A. Gierer, G. Schuster și G. Schramm (1958) și G. Witman (1960 - 1966) au arătat că modificarea chimică a componentei nucleice a TMV duce la apariția diverșilor mutanți ai acestui virus.

În 1970, D. Baltimore și G. Temin au descoperit că transferul de informații genetice poate avea loc nu numai de la ADN la ARN, ci și invers. Ei au găsit în unele virusuri oncogene care conțin ARN (oncornavirusuri) o enzimă specială, așa-numita transcriptază inversă, care este capabilă să sintetizeze ADN complementar pe lanțurile de ARN. Această descoperire majoră a făcut posibilă înțelegerea mecanismului de inserare a informațiilor genetice ale virusurilor care conțin ARN în genomul gazdei și să aruncăm o privire nouă asupra naturii acțiunii lor oncogene.

Descoperirea acizilor nucleici și studiul proprietăților acestora

Termenul de acizi nucleici a fost introdus de biochimistul german R. Altman în 1889, după ce acești compuși au fost descoperiți în 1869 de către medicul elvețian F. Miescher. Misher a extras celulele de puroi cu acid clorhidric diluat timp de câteva săptămâni și a obținut material nuclear aproape pur în rest. El a considerat acest material ca fiind o „substanță caracteristică a nucleelor ​​celulare și a numit-o nucleină. În proprietățile sale, nucleina diferă mult de proteine: era mai acidă, nu conținea sulf, dar conținea mult fosfor, era ușor solubilă. în alcali, dar nu s-a dizolvat în acizi diluați.

Misher a trimis rezultatele observațiilor sale asupra nucleinei lui F. Goppe-Seyler pentru publicare într-un jurnal. Substanța pe care a descris-o era atât de neobișnuită (în acel moment se cunoștea doar lecitină din toți compușii biologici care conțineau fosfor) încât Goppe-Seyler nu a crezut experimentele lui Misher, i-a returnat manuscrisul și ia instruit pe angajații săi N. Plosh și N. Lyubavin să verifica concluziile lui pe alt material . Lucrarea lui Miescher „Despre compoziția chimică a celulelor de puroi” a fost publicată doi ani mai târziu (1871). În același timp, lucrările lui Goppe-Seyler și ale colaboratorilor săi au fost publicate despre compoziția celulelor de puroi, a eritrocitelor de păsări, a șerpilor și a altor celule. În următorii trei ani, nucleina a fost izolată din celule animale și drojdie.

În munca sa, Misher a remarcat că un studiu detaliat al diferitelor nucleine poate duce la stabilirea diferențelor între ele, anticipând astfel ideea specificității acizilor nucleici. În timp ce studia laptele de somon, Misher a descoperit că nucleina din ele este sub formă de sare și este asociată cu proteina principală, pe care a numit-o protamina.

În 1879, A. Kossel a început să studieze nucleinele în laboratorul lui Goppe-Seyler. În 1881, a izolat hipoxantina din nucleină, dar la acea vreme încă se îndoia de originea acestei baze și credea că hipoxantina ar putea fi un produs de degradare al proteinelor. În 1891, printre produsele hidrolizei nucleinei, Kossel a descoperit adenina, guanina, acidul fosforic și o altă substanță cu proprietățile zahărului. Pentru cercetările privind chimia acizilor nucleici, Kossel a fost distins cu Premiul Nobel în 1910.

Progresele ulterioare în descifrarea structurii acizilor nucleici sunt asociate cu cercetările lui P. Levin și colegii (1911 - 1934). În 1911, P. Levin și V. Jacobs au identificat componenta carbohidrată a adenozinei și a guanozinei; au descoperit că aceste nucleozide conţin D-riboză. În 1930, Lewin a arătat că componenta carbohidrată a dezoxiribonucleozidelor este 2-deoxi-D-riboza. Din munca sa, a devenit cunoscut faptul că acizii nucleici sunt construiți din nucleotide, adică nucleozide fosforilate. Levin credea că principalul tip de legătură în acizii nucleici (ARN) este legătura fosfodiester de 2", 5". Această noțiune s-a dovedit a fi greșită. Datorită muncii chimistului englez A. Todd (Premiul Nobel, 1957) și colaboratorilor săi, precum și biochimiștilor englezi R. Markham și J. Smith, s-a cunoscut la începutul anilor 50 că principalul tip de legătură din ARN este de 3", 5" - legătura fosfodiester.

Lewin a arătat că diferiți acizi nucleici pot diferi în ceea ce privește natura componentei carbohidrate: unii dintre ei conțin zahăr dezoxiriboză, în timp ce alții conțin riboză. În plus, aceste două tipuri de acizi nucleici diferă prin natura uneia dintre baze: acizii nucleici de tip pentoză au conținut uracil, iar acizii nucleici de tip deoxipentoză au conținut timină. Acidul nucleic deoxipentoză (în terminologia modernă, acidul dezoxiribonucleic - ADN) era de obicei ușor izolat în cantități mari din timusul (glanda dulce) a vițeilor. Prin urmare, a fost numit acid timonucleic. Sursa de acid nucleic (ARN) de tip pentoză a fost în principal drojdia și germeni de grâu. Acest tip a fost adesea denumit acid nucleic de drojdie.

La începutul anilor 1930, noțiunea că celulele vegetale erau caracterizate de un acid nucleic de tip drojdie era destul de ferm înrădăcinată, în timp ce acidul timonucleic era caracteristic doar nucleelor ​​celulelor animale. Cele două tipuri de acizi nucleici, ARN și ADN, au fost numite atunci acizi nucleici vegetali și, respectiv, animale. Cu toate acestea, așa cum au arătat primele studii ale lui A. N. Belozersky, o astfel de diviziune a acizilor nucleici este nejustificată. În 1934, Belozersky a descoperit pentru prima dată acidul timonucleic în celule vegetale: din răsaduri de mazăre, a izolat și identificat baza timină-pirimidină, care este caracteristică ADN-ului. Apoi a descoperit timina în alte plante (semințe de soia, fasole). În 1936, A. N. Belozersky și I. I. Dubrovskaya au izolat preparativ ADN-ul din puieții de castan de cal. În plus, o serie de studii efectuate în Anglia în anii 1940 de D. Davidson și colegii de muncă au arătat în mod convingător că acidul nucleic vegetal (ARN) este conținut în multe celule animale.

Utilizarea pe scară largă a reacției citochimice pentru ADN dezvoltată de R. Felgen și G. Rosenbeck (1924) și reacția lui J. Brachet (1944) pentru ARN au făcut posibilă rezolvarea rapidă și fără ambiguitate a problemei localizării preferențiale a acestor nucleici. acizi în celulă. S-a dovedit că ADN-ul este concentrat în nucleu, în timp ce ARN-ul este concentrat predominant în citoplasmă. Ulterior, s-a constatat că ARN-ul este conținut atât în ​​citoplasmă, cât și în nucleu și, în plus, a fost identificat și ADN-ul citoplasmatic.

În ceea ce privește problema structurii primare a acizilor nucleici, până la mijlocul anilor 1940, ideea lui P. Levin a fost ferm stabilită în știință, conform căreia toți acizii nucleici sunt construiți după același tip și constau din aceeași așa-numită tetranucleotidă. blocuri. Fiecare dintre aceste blocuri, conform lui Lewin, conține patru nucleotide diferite. Teoria tetranucleotidelor a structurii acizilor nucleici a privat în mare măsură acești biopolimeri de specificitate. Prin urmare, nu este surprinzător că la acea vreme toate particularitățile viețuitoarelor erau asociate numai cu proteine, a căror natura monomerilor este mult mai diversă (20 de aminoacizi).

Prima lacună în teoria structurii tetranucleotidice a acizilor nucleici a fost făcută de datele analitice ale chimistului englez J. Gouland (1945 - 1947). La determinarea compoziției acizilor nucleici prin azotul de bază, el nu a obținut un raport echimolar al bazelor, așa cum ar fi trebuit să fie conform teoriei lui Lewin. În cele din urmă, teoria tetranucleotidică a structurii acizilor nucleici s-a prăbușit ca urmare a cercetărilor lui E. Chargaff și colaboratorilor săi (1949 - 1951). Chargaff a folosit cromatografia pe hârtie pentru a separa bazele eliberate din ADN ca urmare a hidrolizei sale acide. Fiecare dintre aceste baze a fost determinată cu precizie spectrofotometric. Chargaff a observat abateri semnificative de la raportul echimolar al bazelor din ADN de diferite origini și pentru prima dată a afirmat cu siguranță că ADN-ul are o specificitate pronunțată de specie. Acest lucru a pus capăt hegemoniei conceptului de specificitate proteică în celula vie. Analizând ADN-ul de diferite origini, Chargaff a descoperit și formulat modele unice de compoziție a ADN-ului, care au intrat în știință sub numele de regulile lui Chargaff. Conform acestor reguli, în tot ADN-ul, indiferent de origine, cantitatea de adenină este egală cu cantitatea de timină (A = T), cantitatea de guanină este egală cu cantitatea de citozină (G = C), cantitatea de purine este egală cu cantitatea de pirimidine (G + A = C + T), cantitatea de baze cu grupări 6-amino este egală cu numărul de baze cu grupări 6-ceto (A + C = G + T). În același timp, în ciuda unor astfel de corespondențe cantitative stricte, ADN-ul diferitelor specii diferă în ceea ce privește valoarea raportului A+T:G+C. În unele ADN, cantitatea de guanină și citozină prevalează asupra cantității de adenină și timină (Chargaff a numit aceste ADN ADN de tip GC); alte ADN-uri au conținut mai multă adenină și timină decât guanină și citozină (aceste ADN-uri au fost numite ADN de tip AT). Datele obținute de Chargaff cu privire la compoziția ADN-ului au jucat un rol excepțional în biologia moleculară. Aceștia au stat la baza descoperirii structurii ADN-ului, realizată în 1953 de J. Watson și F. Crick.

În 1938, W. Astbury și F. Bell, folosind analiza de difracție cu raze X, au arătat că planurile de bază din ADN ar trebui să fie perpendiculare pe axa lungă a moleculei și să semene, parcă, cu un teanc de plăci aflate deasupra. unul de altul. Odată cu îmbunătățirea tehnicii de analiză prin difracție cu raze X, prin 1952 - 1953. informații acumulate care au făcut posibilă aprecierea lungimii legăturilor individuale și a unghiurilor de înclinare. Acest lucru a făcut posibilă reprezentarea cu cea mai mare probabilitate a naturii orientării inelelor de reziduuri de pentoză din coloana vertebrală zahăr-fosfat a moleculei de ADN. În 1952, S. Farberg a propus două modele speculative de ADN, care reprezentau o moleculă monocatenară pliată sau răsucită pe ea însăși. Un model nu mai puțin speculativ al structurii ADN-ului a fost propus în 1953 de L. Pauling (câștigător al Premiului Nobel, 1954) și R. Corey. În acest model, trei fire răsucite de ADN au format o spirală lungă, al cărei miez era reprezentat de grupări de fosfat, iar bazele erau situate în afara acestuia. Până în 1953, M. Wilkins și R. Franklin au obținut modele de difracție de raze X mai clare ale ADN-ului. Analiza lor a arătat eșecul complet al modelelor lui Farberg, Pauling și Corey. Folosind datele lui Chargaff, comparând diferite combinații de modele moleculare de monomeri individuali și date de difracție de raze X, J. Watson și F. Crick au ajuns în 1953 la concluzia că molecula de ADN trebuie să fie o spirală dublu catenară. Regulile lui Chargaff au limitat sever numărul de combinații ordonate posibile de baze în modelul ADN propus; ei i-au sugerat lui Watson și Crick că trebuie să existe o pereche specifică de baze în molecula de ADN - adenină cu timină și guanină cu citozină. Cu alte cuvinte, adenina dintr-o catenă de ADN corespunde întotdeauna strict timinei din cealaltă catenă, iar guanina dintr-o catenă corespunde în mod necesar citozinei din cealaltă. Astfel, Watson și Crick au fost primii care au formulat principiul extrem de important al structurii complementare a ADN-ului, conform căruia o catenă de ADN o completează pe alta, adică secvența de baze a unei catene determină în mod unic secvența de baze din cealaltă catenă (complementară). . A devenit evident că deja în structura ADN-ului se află potențialul reproducerii sale exacte. Acest model al structurii ADN-ului este în prezent acceptat în general. Crick, Watson și Wilkins au primit Premiul Nobel în 1962 pentru descifrarea structurii ADN-ului.

Trebuie remarcat că ideea unui mecanism pentru reproducerea exactă a macromoleculelor și transmiterea informațiilor ereditare își are originea în țara noastră. În 1927, N. K. Koltsov a sugerat că în timpul reproducerii celulare, reproducerea moleculelor are loc prin reproducerea autocatalitică exactă a moleculelor părinte existente. Adevărat, în acel moment, Koltsov nu a înzestrat această proprietate cu molecule de ADN, ci cu molecule de natură proteică, a căror semnificație funcțională era atunci necunoscută. Cu toate acestea, însăși ideea de reproducere autocatalitică a macromoleculelor și mecanismul de transmitere a proprietăților ereditare s-a dovedit a fi profetică: a devenit ideea călăuzitoare a biologiei moleculare moderne.

Realizat în laboratorul lui A. N. Belozersky de A. S. Spirin, G. N. Zaitseva, B. F. Vanyushin, S. O. Uryson, A. S. Antonov și alții, o varietate de organisme au confirmat pe deplin tiparele descoperite de Chargaff și conformitatea deplină cu modelul molecular al structurii ADN-ului propus de Watson și Crick. Aceste studii au arătat că ADN-ul diferitelor bacterii, ciuperci, alge, actinomicete, plante superioare, nevertebratele și vertebratele au specificitate compozițională. Diferențele de compoziție (conținutul perechilor de baze AT) sunt deosebit de pronunțate la microorganisme, dovedindu-se a fi o caracteristică taxonomică importantă. La plantele și animalele superioare, variațiile speciilor în compoziția ADN-ului sunt mult mai puțin pronunțate. Dar asta nu înseamnă că ADN-ul lor este mai puțin specific. Pe lângă compoziția bazelor, specificitatea este determinată în mare măsură de secvența lor în lanțurile de ADN.

Alături de bazele obișnuite, s-au găsit baze azotate suplimentare în ADN și ARN. Astfel, G. White (1950) a găsit 5-metilcitozină în ADN-ul plantelor și animalelor, iar D. Dunn și J. Smith (1958) au găsit adenină metilată în unele ADN. Multă vreme, metilcitozina a fost considerată un semn distinctiv al materialului genetic al organismelor superioare. În 1968, A. N. Belozersky, B. F. Vanyushin și N. A. Kokurina au descoperit că poate fi găsit și în ADN-ul bacteriilor.

În 1964, M. Gold și J. Hurwitz au descoperit o nouă clasă de enzime care efectuează modificarea naturală a ADN-ului - metilarea acestuia. După această descoperire, a devenit clar că bazele minore (conținute în cantități mici) apar deja pe lanțul de polinucleotide ADN finit ca urmare a metilării specifice a resturilor de citozină și adenină în secvențe speciale. În special, conform lui B. F. Vanyushin, Ya. I. Buryanov și A. N. Belozersky (1969), metilarea adeninei în ADN-ul E. coli poate avea loc în codonii terminali. Potrivit lui A. N. Belozersky și colegilor (1968 - 1970), precum și a lui M. Meselson (SUA) și V. Arber (Elveția) (1965 - 1969), metilarea conferă moleculelor de ADN caracteristici individuale unice și, în combinație cu acțiunea nucleaze specifice, face parte dintr-un mecanism complex care controlează sinteza ADN-ului în celulă. Cu alte cuvinte, natura metilării unui anumit ADN predetermina întrebarea dacă acesta se poate multiplica într-o celulă dată.

Aproape în același timp a început izolarea și studiul intensiv al ADN-metilazelor și al endonucleazelor de restricție; în 1969 - 1975 au fost stabilite secvențele de nucleotide recunoscute în ADN de către unele dintre aceste enzime (X. Boyer, X. Smith, S. Lynn, K. Murray). Atunci când ADN-uri diferite sunt hidrolizate de o enzimă de restricție, fragmente destul de mari cu capete „lipicioase” identice sunt desprinse. Acest lucru face posibilă nu numai analiza structurii genelor, așa cum se face în virușii mici (D. Nathans, S. Adler, 1973 - 1975), ci și construirea diverșilor genomi. Odată cu descoperirea acestor enzime de restricție specifice, ingineria genetică a devenit o realitate tangibilă. Încorporate în mici gene de ADN plasmidic de diverse origini sunt deja introduse cu ușurință în diferite celule. Așadar, s-a obținut un nou tip de plasmide biologic active, care conferă rezistență anumitor antibiotice (S. Cohen, 1973), gene ribozomale ale unei broaște și Drosophila au fost introduse în plasmidele Escherichia coli (J. Morrow, 1974; X. Boyer, D. Hogness, R. Davis, 1974 - 1975). Astfel, sunt deschise căi reale pentru obținerea de organisme fundamental noi prin introducerea și integrarea diferitelor gene în fondul lor de gene. Această descoperire poate fi îndreptată spre beneficiul întregii omeniri.

În 1952, G. White și S. Cohen au descoperit că ADN-ul fagilor T-even conține o bază neobișnuită - 5-hidroximetilcitozină. Mai târziu, din lucrările lui E. Volkin și R. Sinsheimer (1954) și Cohen (1956), s-a știut că reziduurile de hidroximetilcitozină pot fi glucozidate complet sau parțial, drept urmare molecula de ADN fag este protejată de acțiunea hidrolitică. a nucleazelor.

La începutul anilor 1950, din lucrările lui D. Dunn și J. Smith (Anglia), S. Zamenhof (SUA) și A. Wacker (Germania), a devenit cunoscut faptul că mulți analogi de baze artificiale pot fi incluși în ADN, uneori înlocuind până la 50% timină. De regulă, aceste substituții conduc la erori în replicarea, transcripția și traducerea ADN-ului și la apariția mutanților. Astfel, J. Marmur (1962) a constatat că ADN-ul unor fagi conţine oximetiluracil în loc de timină. În 1963, I. Takahashi și J. Marmur au descoperit că ADN-ul unuia dintre fagi conține uracil în loc de timină. Astfel, un alt principiu, conform căruia acizii nucleici au fost separați anterior, s-a prăbușit. Încă din lucrările lui P. Levin s-a crezut că semn distinctiv ADN-ul este timină, iar ARN-ul este uracil. A devenit clar că acest semn nu este întotdeauna de încredere, iar diferența fundamentală în natura chimică a celor două tipuri de acizi nucleici, așa cum pare astăzi, este doar natura componentei carbohidrate.

În studiul fagilor, au fost descoperite multe caracteristici neobișnuite ale organizării acizilor nucleici. Din 1953, se crede că tot ADN-ul sunt molecule liniare dublu-catenar, în timp ce ARN-ul este doar monocatenar. Această poziție a fost zguduită semnificativ în 1961, când R. Sinsheimer a descoperit că ADN-ul fagului φ X 174 este reprezentat de o moleculă circulară monocatenară. Cu toate acestea, mai târziu s-a dovedit că în această formă acest ADN există doar într-o particulă de fag vegetativ, iar forma replicativă a ADN-ului acestui fag este, de asemenea, dublu catenar. În plus, s-a dovedit a fi destul de neașteptat că ARN-ul unor viruși poate fi dublu catenar. Acest nou tip de organizare macromoleculară a ARN a fost descoperit în 1962 de către P. Gomatos, I. Tamm și alți cercetători în unele virusuri animale și în virusul tumorii plăgilor plantelor. Recent, V. I. Agol și A. A. Bogdanov (1970) au stabilit că, pe lângă moleculele liniare de ARN, există și molecule închise sau ciclice. Ei au detectat ARN ciclic dublu catenar, în special, în virusul encefalomielocarditei. Datorită lucrărilor lui X. Deveaux, L. Tinoko, T. I. Tikhonenko, E. I. Budovsky și alții (1960 - 1974), au devenit cunoscute principalele caracteristici ale organizării (așezării) materialului genetic în bacteriofagi.

La sfârșitul anilor 1950, omul de știință american P. Doty a descoperit că încălzirea provoacă denaturarea ADN-ului, care este însoțită de ruperea legăturilor de hidrogen dintre perechile de baze și separarea lanțurilor complementare. Acest proces are caracterul unei tranziții de fază „spiral-coil” și seamănă cu topirea cristalelor. Prin urmare, Doty a numit procesul de denaturare termică a ADN-ului topire a ADN-ului. Odată cu răcirea lentă, are loc renaturarea moleculelor, adică reunificarea jumătăților complementare.

Principiul renaturarii in 1960 a fost folosit de J. Marmur si K. Schildkraut pentru a determina gradul de „hibridabilitate” a ADN-ului diferitelor microorganisme. Ulterior, E. Bolton și B. McCarthy au îmbunătățit această tehnică propunând metoda așa-numitelor coloane ADN-agar. Această metodă s-a dovedit a fi indispensabilă în studierea gradului de omologie a secvenței de nucleotide a diferitor ADN și elucidarea relației genetice a diferitelor organisme. Denaturarea ADN-ului descoperit de Doty în combinație cu cromatografia pe albumină metilată descrisă de J. Mandel și A. Hershey * (1960) și centrifugarea într-un gradient de densitate (metoda a fost dezvoltată în 1957 de M. Meselson, F. Stahl și D. Winograd) este utilizat pe scară largă pentru separarea, izolarea și analiza catenelor individuale complementare de ADN. De exemplu, W. Shibalsky (SUA), folosind aceste tehnici pentru a separa ADN-ul fagului lambda, a arătat în 1967 - 1969 că ambele lanțuri de fagi sunt activ genetic, și nu unul, așa cum era considerat a fi acesta (S. Spiegelman, 1961). Trebuie remarcat faptul că, pentru prima dată, ideea semnificației genetice a ambelor catene de ADN ale fagului lambda a fost exprimată în URSS de SE Bresler (1961).

* (Pentru munca lor asupra geneticii bacteriilor și virusurilor, A. Hershey, împreună cu M. Delbrück și S. Luria, au primit Premiul Nobel în 1969.)

Pentru a înțelege organizarea și activitatea funcțională a genomului, determinarea secvenței de nucleotide ADN este de o importanță capitală. Căutarea metodelor pentru o astfel de determinare se desfășoară în multe laboratoare din întreaga lume. De la sfârșitul anilor 1950, M. Beer și colaboratorii săi au încercat să stabilească secvența ADN folosind microscopia electronică în SUA, dar până acum fără succes. La începutul anilor 1950, de la primele lucrări ale lui Sinsheimer, Chargaff și alți cercetători privind degradarea enzimatică a ADN-ului, a devenit cunoscut faptul că diferite nucleotide dintr-o moleculă de ADN sunt distribuite, deși nu aleatoriu, ci inegal. Potrivit chimistului englez C. Barton (1961), pirimidinele (mai mult de 70%) sunt concentrate în principal sub forma blocurilor corespunzătoare. A. L. Mazin și B. F. Vanyushin (1968 - 1969) au descoperit că diferitele ADN-uri au grade diferite de coeziune a pirimidină și că în ADN-ul organismelor animale crește semnificativ pe măsură ce se deplasează de la inferior la superior. Astfel, evoluția organismelor se reflectă și în structura genomului lor. De aceea, pentru înțelegerea procesului evolutiv în ansamblu, studiul comparativ al structurii acizilor nucleici are o importanță deosebită. Analiza structurii polimerilor importanți biologic și, în primul rând, ADN-ul este extrem de importantă pentru rezolvarea multor probleme particulare de filogenetică și taxonomie.

Este interesant de observat că fiziologul englez E. Lankester, care a studiat hemoglobinele moluștelor, a anticipat ideile biologiei moleculare cu exact 100 de ani în urmă, a scris: „Diferențe chimice ale diferitelor specii și genuri de animale și plante au aceleași importanţă pentru a elucida istoria originii lor, precum și diferențele de formă. Dacă am putea stabili clar diferențele în organizarea moleculară și funcționarea organismelor, am putea înțelege mult mai bine originea și evoluția diferitelor organisme decât pe baza observațiilor morfologice "*. Importanța studiilor biochimice pentru sistematică a fost și ea subliniat de V. L. Komarov, care a scris că „în inima tuturor chiar pur caracteristici morfologice, pe baza cărora clasificăm și stabilim specii, stau tocmai diferențele biochimice” ** .

* (E. R. Lankester. Uber das Vorcommen von Hemoglobin in den Muskeln der Mollusken und die Verbreitung desselben in den lebendigen Organismen.- „Pfluger” s Archiv fur die gesammte Physiol., 1871, Bd 4, 319.)

** (V. L. Komarov. Lucrări alese, vol. 1. M.-L., Editura Academiei de Științe a URSS, 1945, p. 331.)

A. V. Blagoveshchenskii și S. L. Ivanov, încă prin anii 1920, au făcut primii pași în țara noastră pentru a elucida anumite întrebări privind evoluția și sistematica organismelor pe baza unei analize comparative a compoziției biochimice a acestora (vezi capitolul 2). Analiza comparativa structura proteinelor și a acizilor nucleici devine acum un instrument din ce în ce mai tangibil pentru taxonomi (vezi capitolul 21). Această metodă de biologie moleculară permite nu numai să clarifice poziția speciilor individuale în sistem, dar, de asemenea, face necesară o privire nouă asupra principiilor clasificării organismelor și, uneori, revizuirea întregului sistem în ansamblu, ca sa întâmplat, de exemplu, cu sistematica microorganismelor. Fără îndoială, în viitor, analiza structurii genomului va ocupa un loc central în chimiosistematica organismelor.

De o mare importanță pentru dezvoltarea biologiei moleculare a fost descifrarea mecanismelor de replicare și transcripție ADN (vezi capitolul 24).

Biosinteza proteinelor

O schimbare importantă în rezolvarea problemei biosintezei proteinelor este asociată cu progresele în studiul acizilor nucleici. În 1941, T. Kasperson (Suedia) și în 1942, J. Brachet (Belgia) au atras atenția asupra faptului că țesuturile cu sinteza activă a proteinelor conțin o cantitate crescută de ARN. Ei au ajuns la concluzia că acizii ribonucleici joacă un rol decisiv în sinteza proteinelor. În 1953, E. Gale și D. Fox par să fi primit dovezi directe ale implicării directe a ARN-ului în biosinteza proteinelor: conform datelor lor, ribonucleaza a suprimat semnificativ încorporarea aminoacizilor în lizatele celulelor bacteriene. Date similare au fost obținute de V. Olfri, M. Delhi și A. Mirsky (1953) asupra omogenatelor hepatice. Mai târziu, E. Gale a abandonat ideea corectă pe care o exprimase despre rolul principal al ARN-ului în sinteza proteinelor, crezând în mod eronat că activarea sinteza proteineiîntr-un sistem fără celule au apărut sub influența unei alte substanțe de natură necunoscută. În 1954, P. Zamechnik, D. Littlefield, R. B. Khesin-Lurie și alții au descoperit că cea mai activă încorporare a aminoacizilor are loc în fracțiile bogate în ARN ale particulelor subcelulare - microzomi. P. Zamechnik și E. Keller (1953 - 1954) au descoperit că încorporarea aminoacizilor a fost vizibil îmbunătățită în prezența supernatantului în condițiile regenerării ATP. P. Sikevitz (1952) și M. Hoagland (1956) au izolat din supernatant o fracție proteică (fracție pH 5), care a fost responsabilă pentru stimularea bruscă a includerii aminoacizilor în microzomi. Alături de proteine, în supernatant a fost găsită o clasă specială de ARN cu greutate moleculară mică, numită acum ARN de transfer (ARNt). În 1958, Hoagland și Zamechnik, precum și P. Berg, R. Sweet și F. Allen și mulți alți cercetători au descoperit că fiecare aminoacid are nevoie de propria sa enzimă specială, ATP și ARNt specific pentru a se activa. A devenit clar că tARN-urile îndeplinesc exclusiv funcția de adaptoare, adică dispozitive care își găsesc un loc pe matricea nucleică (ARNm) pentru aminoacidul corespunzător din molecula de proteină emergentă. Aceste studii au confirmat pe deplin ipoteza adaptorului a lui F. Crick (1957), care prevedea existența în celulă a adaptoarelor polinucleotidice necesare pentru aranjarea corectă a resturilor de aminoacizi ale proteinei sintetizate pe matricea nucleică. Mult mai târziu, omul de știință francez F. Chapville (1962) în laboratorul lui F. Lipman (Premiul Nobel, 1953) din SUA a arătat foarte ingenios și fără echivoc că localizarea unui aminoacid într-o moleculă de proteină sintetizată este complet determinată de ARNt specific de care este atașat. Ipoteza adaptorului lui Crick a fost dezvoltată de Hoagland și Zamechnik.

Până în 1958, au devenit cunoscute următoarele etape principale ale sintezei proteinelor: 1) activarea unui aminoacid de către o enzimă specifică din „fracția pH 5” în prezența ATP cu formarea adenilat de aminoacil; 2) atașarea unui aminoacid activat la un ARNt specific cu eliberarea de adenozin monofosfat (AMP); 3) legarea aminoacil-ARNt (ARNt încărcat cu un aminoacid) la microzomi și încorporarea aminoacizilor într-o proteină cu eliberare de ARNt. Hoagland (1958) a observat că trifosfatul de guanozină (GTP) este necesar în ultima etapă a sintezei proteinelor.

Transfer ARN-uri și sinteza genelor

După descoperirea ARNt-urilor, au început căutările active pentru fracţionarea lor şi determinarea secvenţei de nucleotide. Biochimistul american R. Holly a obținut cel mai mare succes. În 1965, el a stabilit structura ARNt alaninei din drojdie. Folosind ribonucleaze (guanil RNază și RNază pancreatică), Holly a împărțit molecula de acid nucleic în mai multe fragmente, a determinat secvența de nucleotide în fiecare dintre ele separat și apoi a reconstruit secvența întregii molecule de ARNt de alanină. Acest mod de analiză a secvenței de nucleotide se numește metoda blocului. Meritul lui Holly a constat în principal în faptul că a învățat să împartă molecula de ARN nu numai în bucăți mici, așa cum au făcut mulți înaintea lui, ci și în fragmente mari (sferturi și jumătăți). Acest lucru i-a oferit oportunitatea de a asambla în mod corespunzător bucăți mici individuale și, astfel, de a recrea secvența completă de nucleotide a întregii molecule de ARNt (Premiul Nobel, 1968).

Această tehnică a fost imediat adoptată de multe laboratoare din întreaga lume. În următorii doi ani, în URSS și în străinătate, a fost descifrat structura primara mai multe ARNt deodată. A. A. Baev (1967) și colaboratorii au stabilit pentru prima dată secvența de nucleotide în ARNt-ul valinei de drojdie. Până în prezent, au fost studiate mai mult de o duzină de ARNt-uri individuale diferite. Un record deosebit în determinarea secvenței de nucleotide a fost stabilit la Cambridge de F. Senger și G. Brownlee. Acești cercetători au dezvoltat o metodă surprinzător de elegantă pentru separarea oligonucleotidelor și secvențierea așa-numitului ARN 5 S (ribozomal) din celulele E. coli (1968). Acest ARN constă din 120 de resturi de nucleotide și, spre deosebire de ARNt, nu conține baze minore suplimentare, care facilitează foarte mult analiza secvenței de nucleotide, servind drept repere unice pentru fragmentele individuale ale moleculei. În prezent, datorită utilizării metodei Sanger și Brownlee, lucrările privind studiul secvenței ARN-urilor ribozomale lungi și a unor ARN virali sunt avansate cu succes în laboratorul lui J. Ebel (Franța) și al altor cercetători.

A. A. Baev și colegii (1967) au descoperit că ARNt-ul valinei tăiat în jumătate își restabilește structura macromoleculară în soluție și, în ciuda unui defect în structura primară, are activitatea funcțională a moleculei originale (native). Această abordare - reconstrucția unei macromolecule tăiate după îndepărtarea anumitor fragmente - s-a dovedit a fi foarte promițătoare. Acum este utilizat pe scară largă pentru a elucida rolul funcțional al secțiunilor individuale ale anumitor ARNt.

ÎN anul trecut Un mare succes a fost obținut în obținerea de preparate cristaline ale ARNt-urilor individuale. Multe ARNt au fost deja cristalizate în mai multe laboratoare din SUA și Anglia. Acest lucru a făcut posibilă studierea structurii ARNt folosind analiza de difracție de raze X. În 1970, R. Bock a prezentat primele modele de raze X și modele tridimensionale ale mai multor ARNt pe care le crease la Universitatea din Wisconsin. Aceste modele ajută la determinarea localizării site-urilor individuale active funcțional în ARNt și la înțelegerea principiilor de bază ale funcționării acestor molecule.

De o importanță capitală pentru dezvăluirea mecanismului sintezei proteinelor și rezolvarea problemei specificității acestui proces a fost descifrarea naturii codului genetic (vezi capitolul 24), care, fără exagerare, poate fi considerată drept principala realizare a științele naturii secolului XX.

Descoperirea lui R. Holly a structurii primare a ARNt a dat impuls lucrării lui G. Korana * (SUA) privind sinteza oligonucleotidelor și le-a îndreptat către sinteza unei structuri biologice specifice - o moleculă de ADN care codifică ARNt alaninei. Primii pași în sinteza chimică a oligonucleotidelor scurte realizate de Coran în urmă cu aproape 15 ani au culminat în 1970 cu prima sinteza genică. Koran și colaboratorii săi au sintetizat mai întâi chimic fragmente scurte de 8-12 reziduuri de nucleotide din nucleotide individuale. Aceste fragmente cu o anumită secvență de nucleotide au format spontan piese complementare dublu catenare cu o suprapunere de 4-5 nucleotide. Apoi aceste piese gata făcute au fost unite cap la cap în ordinea corectă folosind enzima ADN ligaza. Astfel, spre deosebire de replicarea moleculelor de ADN, conform lui A. Kornberg** (vezi capitolul 24), Coranul a reușit să recreeze o moleculă naturală de ADN dublu catenar conform unui program pre-planificat în conformitate cu secvența tARN descrisă de Holly. În mod similar, se lucrează acum asupra sintezei altor gene (M. N. Kolosov, Z. A. Shabarova, D. G. Knorre, 1970 - 1975).

* (Pentru studiul codului genetic, G. Koran și M. Nirenberg au primit Premiul Nobel în 1968.)

** (Pentru descoperirea polimerazei și a sintezei ADN-ului A. Kornberg, iar pentru sinteza ARN-ului S. Ochoa a fost distins în 1959 cu Premiul Nobel.)

Microzomi, ribozomi, translație

La mijlocul anilor 1950, se credea că microzomii erau centrul sintezei proteinelor în celulă. Termenul de microzomi a fost introdus pentru prima dată în 1949 de A. Claude pentru a se referi la fracția de granule mici. Mai târziu s-a dovedit că nu întreaga fracțiune de microzomi, constând din membrane și granule, ci doar particule mici de ribonucleoproteină, este responsabilă de sinteza proteinelor. Aceste particule în 1958 au fost numite ribozomi de către R. Roberts.

Studiile clasice ale ribozomilor bacterieni au fost efectuate de A. Tisier și J. Watson în 1958-1959. Ribozomii bacterieni s-au dovedit a fi ceva mai mici decât cei vegetali și animale. J. Littleton (1960), M. Clark (1964) și E. N. Svetailo (1966) au arătat că ribozomii cloroplastelor plantelor superioare și mitocondriilor aparțin tipului bacterian. A. Tisier şi alţii (1958) au descoperit că ribozomii se disociază în două subunităţi inegale care conţin fiecare câte o moleculă de ARN. La sfârșitul anilor 50, se credea că fiecare moleculă de ARN ribozomal constă din mai multe fragmente scurte. Cu toate acestea, AS Spirin în 1960 a fost primul care a arătat că ARN-ul din subparticule este reprezentat de o moleculă continuă. D. Waller (1960), având proteinele ribozomale separate folosind electroforeza pe gel de amidon, a constatat că acestea sunt foarte eterogene. La început, mulți s-au îndoit de datele lui Waller, deoarece părea că proteina ribozomului ar trebui să fie strict omogenă, cum ar fi, de exemplu, proteina TMV. În prezent, ca urmare a cercetărilor lui D. Waller, R. Trout, P. Traub și alți biochimiști, a devenit cunoscut faptul că compoziția particulelor ribozomale reale include mai mult de 50 de proteine ​​care sunt complet diferite ca structură. AS Spirin în 1963 a fost primul care a desfășurat subparticulele ribozomale și a arătat că ribozomii sunt o catenă de ribonucleoproteină răsucită compact, care se poate desfășura în anumite condiții. În 1967 - 1968 M. Nomura a reconstruit complet o subunitate biologic activă din ARN și proteină ribozomal și chiar a obținut ribozomi în care proteina și ARN-ul aparțineau unor microorganisme diferite.

Rolul ARN-ului ribozomal este încă neclar. Se presupune că este acea matrice specifică unică pe care, în timpul formării unei particule ribozomale, fiecare dintre numeroasele proteine ​​ribozomale își găsește un loc strict definit (AS Spirin, 1968).

A. Rich (1962) a descoperit agregate ale mai multor ribozomi interconectați printr-o catenă de ARNm. Aceste complexe au fost numite polizomi. Descoperirea polizomilor a permis lui Rich și Watson (1963) să sugereze că sinteza lanțului polipeptidic are loc pe ribozom, care, așa cum spune, se mișcă de-a lungul lanțului de ARNm. Pe măsură ce ribozomul se mișcă de-a lungul lanțului de ARNm, informațiile sunt citite în particulă și se formează lanțul polipeptidic proteic, iar noii ribozomi se atașează alternativ la capătul citit eliberat al ARNm. Din datele lui Rich și Watson, a rezultat că semnificația polizomilor într-o celulă constă în producția în masă de proteine ​​prin citirea succesivă a matricei de către mai mulți ribozomi simultan.

Ca rezultat al cercetărilor lui M. Nirenberg, S. Ochoa, F. Lipman, G. Korana și alții în 1963 - 1970. a devenit cunoscut faptul că, împreună cu ARNm, ribozomi, ATP și aminoacil-ARNt, un număr mare de diverși factori iau parte la procesul de traducere, iar procesul de traducere în sine poate fi împărțit condiționat în trei etape - inițiere, traducere în sine și terminare.

Inițierea traducerii înseamnă sinteza primei legătură peptidicăîn complexul ribozom - polinucleotidă matriceală - aminoacil-ARNt. O astfel de activitate inițială nu este deținută de orice aminoacil-ARNt, ci de formilmetionil-ARNt. Această substanță a fost izolată pentru prima dată în 1964 de F. Senger și K. Marker. S. Bretcher și K. Marker (1966) au arătat că funcția de inițiere a formilmetionil-ARNt se datorează afinității sale crescute pentru centrul peptidil al ribozomului. Pentru începutul traducerii sunt extrem de importanți și unii factori de inițiere a proteinelor, care au fost izolați în laboratoarele S. Ochoa, F. Gro și în alte centre de cercetare. După formarea primei legături peptidice în ribozom, începe translația în sine, adică adăugarea secvenţială a unui rest aminoacil la capătul C-terminal al polipeptidei. Multe detalii ale procesului de traducere au fost studiate de K. Monroe și J. Bishop (Anglia), I. Rykhlik și F. Shorm (Cehoslovacia), F. Lipman, M. Bretcher, W. Gilbert (SUA) și alți cercetători. În 1968, A. S. Spirin a propus o ipoteză originală pentru a explica mecanismul ribozomului. Mecanismul de antrenare care asigură toate mișcările spațiale ale ARNt și ARNm în timpul translației este deschiderea și închiderea periodică a subparticulelor de ribozom. Terminația de traducere este codificată în matricea lizibilă însăși, care conține codonii de terminare. După cum arată S. Brenner (1965 - 1967), tripleții UAA, UAG și UGA sunt astfel de codoni. M. Capecci (1967) a identificat, de asemenea, factori speciali de terminare a proteinei. AS Spirin și LP Gavrilova au descris așa-numita sinteză a proteinelor „non-enzimatice” în ribozomi (1972 - 1975) fără participarea factorilor proteici. Această descoperire este importantă pentru înțelegerea originii și evoluției biosintezei proteinelor.

Reglarea activității genelor și proteinelor

După problema specificității sintezei proteinelor, problema reglării sintezei proteinelor sau, ceea ce este la fel, reglarea activității genelor, s-a dovedit a fi pe primul loc în biologia moleculară.

Inechivalența funcțională a celulelor și reprimarea și activarea genelor asociate cu aceasta au atras de multă vreme atenția geneticienilor, dar până de curând mecanismul real de control al activității genelor a rămas necunoscut.

Primele încercări de a explica activitatea de reglare a genelor au fost asociate cu studiul proteinelor histonelor. Chiar și soții Steadman * la începutul anilor 40 ai secolului XX. a sugerat că histonele pot juca rolul principal în acest fenomen. Ulterior, au obținut primele date clare privind diferențele în natura chimică a proteinelor histonice. În prezent, numărul faptelor care mărturisesc în favoarea acestei ipoteze crește în fiecare an.

* (E. Stedman, E. Stedman. Proteinele de bază ale nucleelor ​​celulare.- Philosoph. Trans. Roy. soc. Londra, 1951, v. 235, 565 - 595.)

În același timp, totul se acumulează Mai mult date care sugerează că reglarea activității genelor este un proces mult mai complex decât simpla interacțiune a secțiunilor de gene cu moleculele de proteine ​​​​histone. În 1960-1962 în laboratorul lui R. B. Khesin-Lurie, s-a constatat că genele fagilor încep să fie citite non-simultan: genele fagului T2 pot fi împărțite în gene timpurii, a căror funcționare a avut loc în primele minute de infecție. celula bacteriana, și mai târziu, care au început să sintetizeze ARNm după finalizarea lucrării genelor timpurii.

În 1961, biochimiștii francezi F. Jacob și J. Monod au propus o schemă de reglare a activității genelor, care a jucat un rol excepțional în înțelegerea mecanismelor de reglare ale celulei în general. Conform schemei lui Jacob și Monod, pe lângă genele structurale (informaționale), ADN-ul conține și gene-regulatori și gene-operatori. Gena regulatoare codifică sinteza unei substanțe specifice - un represor, care se poate atașa atât la inductor, cât și la gena operator. Gena operator este legată de genele structurale, în timp ce gena regulatoare este situată la o oarecare distanță de acestea. Dacă nu există inductor în mediu, de exemplu, lactoză, atunci represorul sintetizat de gena regulatoare se leagă de gena operatorului și, blocând-o, oprește activitatea întregului operon (un bloc de gene structurale împreună cu operatorul). care le controlează). Formarea enzimelor nu are loc în aceste condiții. Dacă în mediu apare un inductor (lactoză), atunci produsul genei regulatoare, represorul, se leagă de lactoză și îndepărtează blocul din gena operator. În acest caz, munca genei structurale care codifică sinteza enzimei devine posibilă, iar enzima (lactoza) apare în mediu.

Potrivit lui Jacob și Monod, această schemă de reglare este aplicabilă tuturor enzimelor adaptive și poate avea loc atât în ​​timpul represiunii, când formarea enzimei este suprimată de un exces de produs de reacție, cât și în timpul inducției, când introducerea unui substrat provoacă sinteza enzimei. Pentru studiile privind reglarea activității genelor, Jacob și Monod au primit Premiul Nobel în 1965.

Inițial, această schemă părea prea exagerată. Cu toate acestea, mai târziu s-a dovedit că reglarea genelor conform acestui principiu are loc nu numai în bacterii, ci și în alte organisme.

Din 1960, un loc proeminent în biologia moleculară a fost ocupat de studiile privind organizarea genomului și structura cromatinei în organismele eucariote (J. Bonner, R. Britten, W. Olfrey, P. Walker, Yu. S. Chentsov). , I. B. Zbarsky și alții.) și reglementarea transcripției (A. Mirsky, G. P. Georgiev, M. Bernstiel, D. Goll, R. Tsanev, R. I. Salganik). Multă vreme, natura represorului a rămas necunoscută și controversată. În 1968, M. Ptashne (SUA) a arătat că o proteină este un represor. El a izolat-o în laboratorul lui J. Watson și a descoperit că represorul are într-adevăr o afinitate pentru inductor (lactoză) și în același timp „recunoaște” gena operator a operonului lac și se leagă în mod specific de aceasta.

În ultimii 5 - 7 ani s-au obținut date despre prezența unei alte celule de control a activității genei - promotorul. S-a dovedit că lângă site-ul operatorului, de care este atașat produsul sintetizat pe gena regulatoare - substanta proteica represor, există un alt sit, care ar trebui, de asemenea, atribuit membrilor sistemului de reglare a activității genelor. Atașat acestei secțiuni molecula proteica Enzima ARN polimerază. În regiunea promotorului, trebuie să aibă loc recunoașterea reciprocă a secvenței unice de nucleotide din ADN și a configurației specifice a proteinei ARN polimerază. Implementarea procesului de citire a informațiilor genetice cu o secvență dată de gene a operonului adiacent promotorului va depinde de eficiența recunoașterii.

Pe lângă schema descrisă de Jacob și Monod, există și alte mecanisme de reglare a genelor în celulă. F. Jacob și S. Brenner (1963) au stabilit că reglarea replicării ADN-ului bacterian este controlată într-un anumit mod de membrana celulară. Experimentele lui Jacob (1954) privind inducerea diferitelor profagi au arătat în mod convingător că, sub influența diverșilor factori mutageni în celula bacteriilor lizogenice, începe replicarea selectivă a genei profage, iar replicarea genomului gazdă este blocată. În 1970, F. Bell a raportat că moleculele mici de ADN pot trece din nucleu în citoplasmă și pot fi transcrise acolo.

Astfel, activitatea genelor poate fi reglată la nivel de replicare, transcripție și traducere.

S-au făcut progrese semnificative în studierea reglării nu numai a sintezei enzimelor, ci și a activității acestora. A. Novik și L. Szilard au subliniat fenomenele de reglare a activității enzimelor în celulă încă din anii 1950. G. Umbarger (1956) a descoperit că în celulă există o modalitate foarte rațională de a suprima activitatea enzimei. produs final lanțuri de reacție de feedback. După cum au stabilit de J. Monod, J. Change, F. Jacob, A. Purdy și alți cercetători (1956 - 1960), reglarea activității enzimatice poate fi efectuată conform principiului alosteric. Enzima sau una dintre subunitățile sale, în plus față de afinitatea pentru substrat, are o afinitate pentru unul dintre produșii lanțului de reacție. Sub influența unui astfel de produs semnal, enzima își schimbă conformația în așa fel încât își pierde activitatea. Ca urmare, întregul lanț de reacții enzimatice este oprit chiar de la început. D. Wieman și R. Woodward (1952; laureat al Premiului Nobel, 1965) au subliniat rolul esențial al modificărilor conformaționale ale proteinelor în reacțiile enzimatice și, într-un anumit sens, prezența unui efect alosteric.

Structura și funcția proteinelor

Ca rezultat al lucrării lui T. Osborne, G. Hofmeister, A. Gurber, F. Schulz și mulți alții din sfârşitul XIX-lea V. Multe proteine ​​animale și vegetale au fost obținute sub formă cristalină. Aproximativ în același timp, greutățile moleculare ale anumitor proteine ​​au fost determinate folosind diferite metode fizice. Deci, în 1891, A. Sabaneev și N. Alexandrov au raportat că greutatea moleculară a ovalbuminei este de 14.000; în 1905, E. Reid a descoperit că greutatea moleculară a hemoglobinei este de 48 000. Structura polimerică a proteinelor a fost descoperită în 1871 de G. Glasivetz și D. Gaberman. Ideea unei legături peptidice a resturilor individuale de aminoacizi din proteine ​​a fost propusă de T. Curtius (1883). Lucrări privind condensarea chimică a aminoacizilor (E. Schaal, 1871; G. Schiff, 1897; L. Balbiano și D. Traschiatti, 1900) și sinteza heteropolipeptidelor (E. Fisher, 1902 - 1907, Premiul Nobel, 1902) a condus la dezvoltarea principiilor de bază structura chimica proteine.

Prima enzimă cristalină (urează) a fost obținută în 1926 de J. Sumner (Premiul Nobel, 1946), iar în 1930 J. Northrop (Premiul Nobel, 1946) a obținut pepsină cristalină. După aceste lucrări, a devenit clar că enzimele sunt de natură proteică. În 1940, M. Kunits a izolat RNaza cristalină. Până în 1958, erau deja cunoscute peste 100 de enzime cristaline și peste 500 de enzime necristaline. Obținerea de preparate foarte purificate de proteine ​​individuale a contribuit la descifrarea structurii lor primare și a organizării macromoleculare.

De mare importanță pentru dezvoltarea biologiei moleculare în general și a geneticii umane, în special, a fost descoperirea de către L. Pauling (1940) a hemoglobinei S anormale, izolată din eritrocitele persoanelor cu o boală ereditară severă, anemia falciforme. În 1955 - 1957 W. Ingram a folosit metoda „amprentei” dezvoltată de F. Sanger (pete formate din peptide individuale în timpul cromatografiei pe hârtie) pentru a analiza produsele hidrolizei hemoglobinei S cu alcalii și tripsină. În 1961, Ingram a raportat că hemoglobina S diferă de hemoglobina normală doar prin natura unui rest de aminoacid: în hemoglobina normală, un reziduu de acid glutamic se află în poziția a șaptea a lanțului, iar în hemoglobina S, un reziduu de valină. Astfel, ipoteza lui Pauling (1949) conform căreia anemia secerată este o boală de natură moleculară a fost pe deplin confirmată. O modificare moștenită a unui singur reziduu de aminoacizi în fiecare jumătate a macromoleculei de hemoglobină duce la faptul că hemoglobina își pierde capacitatea de a se dizolva cu ușurință la o concentrație scăzută de oxigen și începe să se cristalizeze, ceea ce duce la perturbarea structurii celulare. Aceste studii au arătat în mod clar că structura unei proteine ​​este o secvență de aminoacizi strict definită, care este codificată în genom. Lucrările lui K. Anfinsen (1951) au mărturisit importanța excepțională a structurii primare a unei proteine ​​în formarea unei conformații unice biologic active a unei macromolecule. Anfinsen a arătat că macrostructura biologic activă a ribonucleazei pancreatice, care se pierde ca urmare a restaurării, este predeterminată de secvența de aminoacizi și poate reapărea spontan în timpul oxidării grupărilor SH ale reziduurilor de cisteină cu formarea de legături disulfuri încrucișate strict. locuri definite ale lanțului peptidic al enzimei.

Până în prezent, mecanismul de acțiune a fost studiat în detaliu. un numar mare enzimele și structura multor proteine ​​a fost determinată.

În 1953, F. Sanger a stabilit secvența de aminoacizi a insulinei. : Această proteină constă din două lanțuri polipeptidice conectate prin două legături disulfurice. Unul dintre lanțuri conține doar 21 de resturi de aminoacizi, în timp ce celălalt conține 30 de resturi. Sanger a petrecut aproximativ 10 ani descifrând structura acestei proteine ​​relativ simple. În 1958 i s-a acordat Premiul Nobel pentru această cercetare remarcabilă. După crearea de către V. Stein și S. Moore (1957) a unui analizor automat de aminoacizi, identificarea produselor de hidroliză parțială a proteinelor s-a accelerat semnificativ. În 1960, Stein și Moore au raportat deja acest lucru. că au putut determina secvența ribonucleazei, al cărei lanț peptidic este reprezentat de 124 de resturi de aminoacizi. În același an, în laboratorul lui G. Schramm din Tübingen (Germania), F. Anderer și alții au determinat secvența de aminoacizi din proteina TMV. Apoi, secvența de aminoacizi a fost determinată în mioglobină (A. Edmunson) și lanțurile α și β ale hemoglobinei umane (G. Braunitzer, E. Schroeder, etc.), lizozima din proteina din ou (J. Jollet, D. Keyfield) . În 1963, F. Shorm și B. Keil (Cehoslovacia) au stabilit secvența de aminoacizi în molecula de chimotripsinogen. În același an, a fost determinată secvența de aminoacizi a tripsinogenului (F. Shorm, D. Walsh). În 1965, K. Takahashi a stabilit structura primară a ribonucleazei T1. Apoi a fost determinată secvența de aminoacizi pentru mai multe proteine.

După cum se știe, dovada finală a corectitudinii definiției unei anumite structuri este sinteza acesteia. În 1969, R. Merifield (SUA) a fost primul care a efectuat sinteza chimică a ribonucleazei pancreatice. Folosind metoda de sinteză pe care a dezvoltat-o ​​pe un purtător în fază solidă, Merifield a adăugat un aminoacid după altul în lanț în conformitate cu secvența descrisă de Stein și Moore. Drept urmare, el a primit o proteină care era identică ca calități cu ribonucleaza pancreatică A. Pentru descoperirea structurii ribonucleazei, V. Stein, S. Moore și K. Anfinsen au primit Premiul Nobel în 1972. Această sinteză naturală de proteine ​​deschide perspective extraordinare, indicând posibilitatea de a crea orice proteine ​​în conformitate cu o secvență pre-planificată.

Din studiile cu raze X ale lui W. Astbury (1933) a rezultat că lanțurile peptidice ale moleculelor de proteine ​​sunt răsucite sau stivuite într-un mod strict definit. Din acel moment, mulți autori au exprimat diverse ipoteze despre modalitățile în care sunt pliate lanțurile proteice, dar până în 1951, toate modelele au rămas construcții speculative care nu corespundeau datelor experimentale. În 1951, L. Pauling și R. Corey au publicat o serie de lucrări geniale în care a fost formulată în sfârșit teoria structurii secundare a proteinelor, teoria α-helixului. Odată cu aceasta, a devenit cunoscut și faptul că proteinele au și o structură terțiară: α-helixul lanțului peptidic poate fi pliat într-un anumit fel, formând o structură destul de compactă.

În 1957, J. Kendrew și colaboratorii săi au propus pentru prima dată un model tridimensional al structurii mioglobinei. Acest model a fost apoi rafinat pe parcursul mai multor ani, pana cand in 1961 a aparut lucrare finală cu o caracteristică a structurii spaţiale a acestei proteine. În 1959, M. Perutz și colegii au stabilit structura tridimensională a hemoglobinei. Cercetătorii au petrecut peste 20 de ani pe această lucrare (primele raze X ale hemoglobinei au fost obținute de Perutz în 1937). Deoarece molecula de hemoglobină este formată din patru subunități, după ce și-a descifrat organizarea, Perutz a descris astfel mai întâi structura cuaternară a proteinei. Pentru munca lor privind determinarea structurii tridimensionale a proteinelor, Kendrew și Perutz au primit Premiul Nobel în 1962.

Crearea unui model spațial al structurii hemoglobinei de către Perutz PERMIS. să se apropie de înțelegerea mecanismului de funcționare al acestei proteine, care, după cum se știe, efectuează transportul oxigenului în celulele animale. În 1937, F. Gaurowitz a ajuns la concluzia că interacțiunea hemoglobinei cu oxigenul, aerul ar trebui să fie însoțită de o modificare a structurii proteinei. În anii 1960, Perutz și colegii de muncă au descoperit o schimbare vizibilă a lanțurilor hemoglobinei după oxidarea acesteia, cauzată de deplasarea atomilor de fier ca urmare a legării cu oxigenul. Pe această bază s-au format idei despre „respirația” macromoleculelor proteice.

În 1960, D. Phillips și colaboratorii săi au început studiile de difracție cu raze X ale moleculei de lizozim. Până în 1967, ei au fost mai mult sau mai puțin capabili să stabilească detaliile organizării acestei proteine ​​și localizarea atomilor individuali în molecula ei. În plus, Phillips a descoperit natura adăugării lizozimei la substrat (triacetilglucozamină). Acest lucru a făcut posibilă recrearea mecanismului acestei enzime. Astfel, cunoașterea structurii primare și a organizării macromoleculare a făcut posibilă nu numai stabilirea naturii centrilor activi ai multor enzime, ci și dezvăluirea completă a mecanismului de funcționare a acestor macromolecule.

Utilizarea metodelor de microscopie electronică a ajutat la dezvăluirea principiilor organizării macromoleculare a unor astfel de formațiuni proteice complexe precum colagenul, fibrinogenul, fibrile musculare contractile etc. La sfârșitul anilor 1950 au fost propuse modele ale aparatului contractil muscular. De o importanță excepțională pentru înțelegerea mecanismului contracției musculare a fost descoperirea de către V. A. Engelgardt și M. N. Lyubimova (1939) a activității ATPazei miozinei. Aceasta a însemnat că actul de contracție musculară se bazează pe o modificare a proprietăților fizico-chimice și a organizării macromoleculare a proteinei contractile sub influența acidului adenozin trifosforic (vezi și Capitolul 11).

Cercetarea virologică a fost esențială pentru înțelegerea principiilor de asamblare a structurilor biologice (vezi capitolul 25).

Probleme nerezolvate

Principalele progrese în biologia moleculară modernă au fost realizate în principal ca urmare a studiului acizilor nucleici. Cu toate acestea, chiar și în acest domeniu departe de toate problemele au fost rezolvate. Vor fi necesare eforturi mari, în special, pentru a descifra întreaga secvență de nucleotide a genomului. Această problemă, la rândul său, este indisolubil legată de problema eterogenității ADN-ului și necesită dezvoltarea de noi metode avansate pentru fracționarea și izolarea moleculelor individuale din materialul genetic total al celulei.

Până acum, eforturile s-au concentrat în principal pe studiul separat al proteinelor și al acizilor nucleici. În celulă, acești biopolimeri sunt legați în mod indisolubil unul de celălalt și funcționează în principal sub formă de nucleoproteine. Prin urmare, nevoia de a studia interacțiunea proteinelor și acizilor nucleici a devenit acum deosebit de acută. Problema recunoașterii anumitor secțiuni de acizi nucleici de către proteine ​​este adusă în prim-plan. Pașii au fost deja schițați pentru studierea unei astfel de interacțiuni a acestor biopolimeri, fără de care o înțelegere completă a structurii și funcțiilor cromozomilor, ribozomilor și altor structuri este de neconceput. Fără aceasta, este, de asemenea, imposibil de înțeles reglarea activității genelor și, în cele din urmă, de a descifra principiile activității mecanismelor de sinteză a proteinelor. După lucrările lui Jacob și Monod, au apărut câteva date noi cu privire la semnificația de reglementare a membranelor în sinteza materialului nuclear. Aceasta pune problema unui studiu mai profund al rolului membranelor în reglarea replicării ADN-ului. În general, problema reglării activității genelor și a activității celulare în general a devenit una dintre cele mai importante probleme ale biologiei moleculare moderne.

Starea actuală a biofizicii

În strânsă legătură cu problemele biologiei moleculare, a continuat dezvoltarea biofizicii. Interesul pentru această zonă a biologiei a fost stimulat, pe de o parte, de necesitatea unui studiu cuprinzător al efectului diferitelor tipuri de radiații asupra organismului și, pe de altă parte, de necesitatea studierii fizice și fundamentele fizico-chimice ale fenomenelor vieţii care au loc la nivel molecular.

Obținerea de informații precise despre structurile moleculare și procesele care au loc în ele a devenit posibilă ca urmare a utilizării noilor metode fizice și chimice fine. Pe baza realizărilor electrochimiei, a fost posibilă îmbunătățirea metodei de măsurare a potențialelor bioelectrice prin utilizarea electrozilor ion-selectivi (G. Eisenman, B.P. Nikolsky, Khuri, 50-60s). Din ce în ce mai mult, intră în practică spectroscopia în infraroșu (cu utilizarea dispozitivelor laser), ceea ce face posibilă studierea modificărilor conformaționale ale proteinelor (I. Plotnikov, 1940). Informații prețioase sunt oferite și de metoda rezonanței paramagnetice electronice (E. K. Zavoisky, 1944) și metoda biochimiluminiscente (B. N. Tarusov și colab., 1960), care fac posibilă, în special, judecarea transportului electronilor în timpul proceselor oxidative.

În anii 1950, biofizica câștiga deja o poziție puternică. Este nevoie de formarea unor specialiști calificați. Dacă în 1911 în Europa doar Universitatea din Pécs, din Ungaria, avea catedra de biofizică, atunci până în 1973 astfel de catedre există în aproape toate universitățile importante.

În 1960, a fost organizată Societatea Internațională a Biofizicienilor. În august 1961, la Stockholm a avut loc primul Congres Internațional de Biofizică. Al doilea congres a avut loc în 1965 la Paris, al treilea - în 1969 la Boston, al patrulea - în 1972 la Moscova.

În biofizică, există o distincție clară între două domenii cu conținut diferit - biofizica moleculară și biofizica celulară. Această distincție primește și o expresie organizațională: se creează departamente separate din aceste două domenii ale biofizicii. La Universitatea din Moscova, primul departament de biofizică a fost creat în 1953 la Facultatea de Biologie și Știința Solului, iar puțin mai târziu a apărut Departamentul de Biofizică la Facultatea de Fizică. Departamentele au fost organizate pe același principiu în multe alte universități.

Biofizica moleculara

În ultimii ani, legătura dintre biofizica moleculară și biologia moleculară a fost din ce în ce mai consolidată, iar acum este uneori dificil de determinat unde se află linia de demarcație dintre ele. Într-un atac general asupra problemei informațiilor ereditare, o astfel de cooperare între biofizică și biologia moleculară este inevitabilă.

Direcția principală în muncă de cercetare este studiul fizicii acizilor nucleici - ADN și ARN. Utilizarea metodelor de mai sus și, mai ales, analiza de difracție cu raze X a contribuit la descifrarea structurii moleculare a acizilor nucleici. În prezent, se desfășoară cercetări intense pentru a studia comportamentul acestor acizi în soluții. O atenție deosebită se acordă tranzițiilor conformaționale „helix-coil”, care sunt studiate prin modificări ale vâscozității, parametrilor optici și electrici. În legătură cu studiul mecanismelor de mutageneză, sunt în curs de dezvoltare studii pentru a studia efectul radiațiilor ionizante asupra comportamentului acizilor nucleici în soluții, precum și efectul radiațiilor asupra acizilor nucleici ai virusurilor și fagilor. Efectul radiațiilor ultraviolete, dintre care unele regiuni spectrale sunt cunoscute a fi bine absorbite de acizii nucleici, a fost supus unei analize cuprinzătoare. Mare gravitație specificăîn acest gen de cercetare este detectarea radicalilor activi ai acizilor nucleici și proteinelor prin metoda rezonanței paramagnetice electronice. Cu utilizarea acestei metode, este asociată apariția unei întregi direcții independente.

Problema codificării informațiilor ADN și ARN și transmiterea acesteia în timpul sintezei proteinelor a fost de multă vreme de interes pentru biofizica moleculară, iar fizicienii au exprimat în mod repetat anumite considerații pe acest subiect (E. Schrödinger, G. Gamow). Descifrarea codului genetic a determinat numeroase studii teoretice și experimentale asupra structurii helixului ADN, a mecanismului de alunecare și răsucire a firelor sale, asupra studiului. forță fizică implicate în aceste procese.

Biofizica moleculară oferă o asistență considerabilă biologiei moleculare în studierea structurii moleculelor de proteine ​​cu ajutorul analizei de difracție cu raze X, care a fost folosită pentru prima dată în 1930 de J. Bernal. În urma utilizării metodelor fizice în combinație cu metode biochimice (metode enzimatice), au fost dezvăluite conformația moleculară și secvența aminoacizilor dintr-un număr de proteine.

Studiile moderne de microscopie electronică, care au dezvăluit prezența sistemelor complexe de membrană în celule și organele sale, au stimulat încercările de a înțelege structura lor moleculară (vezi capitolele 10 și 11). Studiat in vivo compoziție chimică membranelor și, în special, proprietățile lipidelor acestora. S-a constatat că acestea din urmă sunt capabile de supraoxidare și reacții neenzimatice de oxidare în lanț (Yu. A. Vladimirov și F. F. Litvin, 1959; B. N. Tarusov și colab., 1960; I. I. Ivanov, 1967), conducând la disfuncția membranei. Pentru a studia compoziția membranelor au început să fie utilizate și metode de modelare matematică (V. Ts. Presman, 1964 - 1968; M. M. Shemyakin, 1967; Yu. A. Ovchinnikov, 1972).

Biofizica celulara

Un eveniment semnificativ din istoria biofizicii a fost formarea în anii '50 a unor idei clare despre termodinamică procese biologice, în urma cărora au dispărut în cele din urmă ipotezele despre posibilitatea generării independente de energie în celulele vii, contrar celei de-a doua legi a termodinamicii. Înțelegerea funcționării acestei legi în sistemele biologice este asociată cu introducerea de către omul de știință belgian I. Prigozhin (1945) * în termodinamica biologică a conceptului sisteme deschise care fac schimb de energie și materie cu mediul înconjurător. Prigogine a arătat că entropia pozitivă se formează în celulele vii în timpul proceselor de lucru în conformitate cu cea de-a doua lege a termodinamicii. Ecuațiile pe care le-a introdus au determinat condițiile în care apare așa-numita stare staționară (anterior era numită și echilibru dinamic), în care cantitatea energie gratis(negentropia) care intră în celule cu alimente compensează consumul acesteia, iar entropia pozitivă este excretată. Această descoperire a întărit ideea biologică generală a conexiunii inseparabile dintre mediul extern și cel intern al celulelor. A marcat începutul unui adevărat studiu al termodinamicii sistemelor vii, inclusiv metoda modelării (A. Burton, 1939; A. G. Pasynsky, 1967).

* (teorie generală sistemele deschise a fost propus pentru prima dată de L. Bertalanffy în 1932.)

Conform principiului de bază al biotermodinamicii, conditie necesara Existența vieții se dovedește a fi staționară în dezvoltarea proceselor sale biochimice, pentru a căror implementare este necesară coordonarea ratelor numeroaselor reacții metabolice. Pe baza noii termodinamici biofizice, a apărut o tendință care evidențiază factorii externi și interni care asigură această coordonare a reacțiilor și o fac stabilă. În ultimele două decenii, a fost evidențiat un rol important în menținerea stării staționare a sistemului de inhibitori și în special de antioxidanți (B. N. Tarusov și A. I. Zhuravlev, 1954, 1958). S-a stabilit că fiabilitatea dezvoltării staționare este asociată cu factorii de mediu (temperatura) și cu proprietățile fizico-chimice ale mediului celular.

Principiile moderne ale biotermodinamicii au făcut posibilă interpretarea fizico-chimică a mecanismului de adaptare. Conform datelor noastre, adaptarea la condițiile de mediu poate avea loc numai dacă, atunci când acestea se schimbă, organismul este capabil să stabilească staționaritatea în dezvoltarea bio. reacții chimice(B. N. Tarusov, 1974). A apărut problema dezvoltării de noi metode care să permită evaluarea stării staționare in vivo și prezicerea posibilelor încălcări ale acesteia. Introducerea principiilor cibernetice ale sistemelor de autoreglare în biotermodinamică și cercetarea proceselor de adaptare biologică promite un mare beneficiu. A devenit clar că, pentru a rezolva problema stabilității stării de echilibru, este important să se țină cont de așa-numiții factori perturbatori, care includ, în special, reacții neenzimatice de oxidare a lipidelor. ÎN În ultima vreme cercetările privind procesele de supraoxidare în fazele lipidice ale celulelor vii și creșterea produselor radicale active care perturbă funcțiile de reglare ale membranelor se extind din ce în ce mai mult. Sursa de informații despre aceste procese este atât detectarea radicalilor peroxidi activi, cât și a compușilor peroxidici ai biolipidelor (A. Tappel, 1965; I. I. Ivanov, 1965; E. B. Burlakova, 1967 și alții). Pentru a detecta radicalii, se folosește biochimiluminiscența, care apare în lipidele celulelor vii în timpul recombinării acestora.

Pe baza ideilor fizico-chimice despre stabilitatea stării de echilibru, au apărut idei biofizice despre adaptarea plantelor la schimbările condițiilor de mediu ca o încălcare a sistemelor antioxidante inhibitoare (B. N. Tarusov, Ya. E. Doskoch, B. M. Kitlaev, A. M. Agaverdiev , 1968 - 1972). Acest lucru a deschis posibilitatea de a evalua proprietăți precum rezistența la îngheț și toleranța la sare, precum și de a face previziuni adecvate în selectarea plantelor agricole.

În anii 1950, a fost descoperită o strălucire ultra-slabă - biochimiluminiscența unui număr de obiecte biologice în părțile vizibile și infraroșii ale spectrului (B. N. Tarusov, A. I. Zhuravlev, A. I. Polivoda). Acest lucru a devenit posibil ca urmare a dezvoltării metodelor de înregistrare a fluxurilor de lumină super slabe folosind fotomultiplicatori (L. A. Kubetsky, 1934). Fiind rezultatul reacțiilor biochimice care au loc într-o celulă vie, biochimiluminiscența face posibilă aprecierea proceselor oxidative importante în lanțurile de transfer de electroni dintre enzime. Descoperirea și studiul biochimiluminiscenței are o mare importanță teoretică și practică. Astfel, B. N. Tarusov și Yu. radiatii ionizante, cu carcinogeneză și alte tulburări funcții normale celule.

În anii 1950, în legătură cu dezvoltarea rapidă a fizicii nucleare, radiobiologia a apărut din biofizică. actiune biologica radiatii ionizante. Obținerea de izotopi radioactivi artificiali, crearea de arme termonucleare, reactoare nucleare iar dezvoltarea altor forme de utilizare practică a energiei atomice a pus cu toată acuitatea ei problema protejării organismelor de acțiune dăunătoare radiații ionizante, dezvoltare fundamente teoretice prevenirea și tratamentul bolii radiațiilor. Pentru a face acest lucru, a fost necesar în primul rând să aflăm care componente ale celulei și legăturile metabolismului sunt cele mai vulnerabile.

Obiectul de studiu în biofizică și radiobiologie a fost elucidarea naturii reacțiilor chimice primare care au loc în substraturile vii sub influența energiei radiațiilor. Aici a fost important nu doar să înțelegem mecanismele acestui fenomen, ci și să putem influența procesul de schimb de energie fizică cu energie chimică, pentru a-i reduce coeficientul de acțiune „utilă”. Lucrările în această direcție au fost inițiate de studiile școlii lui N. N. Semenov (1933) în URSS și D. Hinshelwood (1935) în Anglia.

Un loc important în cercetarea radiobiologică l-a ocupat studiul gradului de rezistență la radiații a diferitelor organisme. S-a constatat că radiorezistența crescută (de exemplu, la rozătoarele din deșert) se datorează activității antioxidante ridicate a lipidelor membranei celulare (M. Chang și colab., 1964; N. K. Ogryzov și colab., 1969). S-a dovedit că tocoferolii, vitamina K și compușii tio joacă un rol important în formarea proprietăților antioxidante ale acestor sisteme (II Ivanov și colab., 1972). În ultimii ani, studiile asupra mecanismelor mutagenezei au atras, de asemenea, multă atenție. În acest scop, se studiază efectul radiațiilor ionizante asupra comportamentului acizilor nucleici și proteinelor in vitro, precum și în viruși și fagi (A. Gustafson, 1945 - 1950).

Lupta pentru o creștere în continuare a eficacității protecției chimice, căutarea unor inhibitori mai eficienți și principii de inhibiție rămân principalele sarcini ale biofizicii în această direcție.

S-au făcut progrese în studiul stărilor excitate ale biopolimerilor, care determină activitatea lor chimică ridicată. Cel mai de succes a fost studiul stărilor excitate care apar în stadiul primar al proceselor fotobiologice - fotosinteza și viziunea.

Astfel, s-a adus o contribuție solidă la înțelegerea activării primare a moleculelor sistemelor de pigment vegetal. S-a stabilit marea importanță a transferului (migrației) energiei stărilor excitate fără pierderi de la pigmenții activați către alte substraturi. Un rol major în dezvoltarea acestor idei l-au jucat lucrările teoretice ale lui A. N. Terenin (1947 și mai târziu). A. A. Krasnovsky (1949) a descoperit și studiat reacția de reducere fotochimică reversibilă a clorofilei și a analogilor ei. Există acum o credință generală că în viitorul apropiat va fi posibilă reproducerea fotosintezei în condiții artificiale (vezi și capitolul 5).

Biofizicienii continuă să lucreze la descoperirea naturii contracției musculare și a mecanismelor excitare nervoasăși conduită (vezi capitolul 11). Cercetarea mecanismelor de tranziție de la o stare excitată la o stare normală a devenit, de asemenea, de importanță curentă. Starea excitată este acum considerată ca rezultat al unei reacții autocatalitice, iar inhibarea este considerată o consecință a unei mobilizări puternice a activității antioxidante inhibitoare ca urmare a rearanjamentelor moleculare în compuși precum tocoferol (I. I. Ivanov, O. R. Kols, 1966; O. R. Kols, 1970).

Cea mai importantă problemă generală a biofizicii rămâne cunoașterea caracteristicilor fizice și chimice calitative ale materiei vii. Proprietăți precum capacitatea biopolimerilor vii de a lega selectiv potasiul sau de a polariza electricitate, nu poate fi păstrat nici cu cea mai atentă îndepărtare din corp. Prin urmare, biofizica celulară continuă să dezvolte intens criterii și metode pentru studiul pe durata vieții materiei vii.

În ciuda tinereții biologiei moleculare, progresul pe care a făcut-o în acest domeniu este cu adevărat uimitor. Într-o perioadă relativ scurtă de timp au fost stabilite natura genei și principiile de bază ale organizării, reproducerii și funcționării acesteia. Mai mult, nu numai reproducerea in vitro a genelor a fost efectuată, ci și pentru prima dată s-a finalizat sinteza completă a genei în sine. Codul genetic a fost complet descifrat și cea mai importantă problemă biologică a specificității biosintezei proteinelor a fost rezolvată. Au fost identificate și studiate principalele căi și mecanisme de formare a proteinelor în celulă. Structura primară a multora ARN de transport- molecule adaptoare specifice care traduc limbajul modelelor nucleice în limbajul secvenței de aminoacizi a proteinei sintetizate. Secvența de aminoacizi a multor proteine ​​a fost complet descifrată și structura spațială a unora dintre ele a fost stabilită. Acest lucru a făcut posibilă elucidarea principiului și detaliilor funcționării moleculelor de enzime. S-a efectuat sinteza chimică a uneia dintre enzime, ribonucleaza. S-au stabilit principiile de bază ale organizării diferitelor particule subcelulare, a multor virusuri și fagi și au fost dezvăluite principalele modalități de biogeneză a acestora în celulă. Au fost descoperite abordări de înțelegere a modalităților de reglare a activității genelor și de elucidare a mecanismelor de reglare a activității vitale. Deja o listă simplă a acestor descoperiri indică faptul că a doua jumătate a secolului al XX-lea. a fost marcat de progrese extraordinare în biologie, care se datorează în primul rând unui studiu aprofundat al structurii și funcțiilor macromoleculelor importante din punct de vedere biologic - acizi nucleici și proteine.

Realizările în biologia moleculară sunt deja folosite în practică astăzi și aduc rezultate tangibile în medicină, agricultură și unele industrii. Nu există nicio îndoială că revenirea acestei științe va crește în fiecare zi. Cu toate acestea, principalul rezultat ar trebui totuși considerat că sub influența succeselor biologiei moleculare s-a întărit încrederea în existența unor posibilități nelimitate pe calea dezvăluirii celor mai secrete secrete ale vieții.

În viitor, se pare că se vor deschide noi modalități de studiere a formei biologice a mișcării materiei - biologia se va muta de la nivel molecular la nivel atomic. Cu toate acestea, acum probabil că nu există un singur cercetător care ar putea prezice în mod realist dezvoltarea biologiei moleculare chiar și pentru următorii 20 de ani.

interviu

Pirogov Sergey - un participant la pregătirea pentru Olimpiada de biologie, organizată de „Elephant and Giraffe” în 2012.
Câștigător al Universiadei Internaționale de Biologie
Câștigătorul olimpiadei „Lomonosov”
Câștigător al etapei regionale Olimpiada integrală rusească la biologie în 2012
Studiază la Universitatea de Stat din Moscova. M.V. Lomonosov la Facultatea de Biologie: Catedra de Biologie Moleculară, student în anul VI. Lucrează în Laboratorul de Genetică Biochimică a Animalelor al Institutului de Genetică Moleculară.

- Seryozha, dacă cititorii au întrebări, vă vor putea întreba?

Da, desigur, puteți pune întrebări cel puțin imediat. În acest domeniu:

Faceți clic aici pentru a pune o întrebare.

- Să începem cu școala, nu ai avut o școală super-mișto?

Am studiat la o școală foarte slabă din Moscova, un liceu atât de mediu. Adevărat, am avut un profesor minunat la Teatrul de Artă din Moscova, datorită căruia am avut o orientare în mare parte nominală de „istoria artei” a școlii.

- Dar biologie?

Profesorul nostru de biologie era o femeie foarte în vârstă, surdă și ascuțită, de care toată lumea se temea. Dar dragostea pentru subiectul ei nu a adăugat. Sunt pasionat de biologie încă din copilărie, de la vârsta de cinci ani. Am citit totul singur, fiind purtată în principal de anatomie și zoologie. Asa de rechizite exista paralel cu propriile mele interese. Jocurile Olimpice au schimbat totul.

- Spune-mi mai mult despre aceasta.

În clasa a VII-a am participat pentru prima dată la etapa municipală (desigur, la aproape toate materiile deodată, fiind singurul elev pe care profesorii aveau de ce să-l trimită). Și a câștigat la biologie. Apoi școala a tratat acest lucru ca pe un fapt amuzant, dar nu foarte interesant.

- Te-a ajutat la școală?

Îmi amintesc că, în ciuda studiilor mele strălucitoare, am primit adesea B de la un profesor de biologie cu strângere de niște de genul „în desenul unei secțiuni de ceapă, rădăcinile ar trebui să fie vopsite maro, nu gri”. Totul a fost destul de deprimant. În clasa a VIII-a am fost din nou la olimpiada, dar din anumite motive nu am fost trimis la biologie. Dar a devenit câștigător și premiat la alte materii.

- Ce s-a întâmplat în clasa a IX-a?

În clasa a IX-a nu am mers la etapa raională. Acolo am înscris în mod neașteptat un scor slab, la limită, care, totuși, s-a dovedit a trece la etapa regională. A avut o forță de motivare puternică - realizarea cât de multe nu știu și câți oameni care știu toate acestea (câți astfel de oameni la scară națională chiar îmi era teamă să-mi imaginez).

- Spune-ne cum te-ai pregătit.

Studiul individual intensiv, incursiunile în librării și mii de sarcini de anul trecut au avut un efect vindecător. Am obținut unul dintre cele mai mari scoruri la teorie (care a fost și pentru mine complet neașteptat), am trecut la etapa practică... și am eșuat. Pe vremea aceea, nici măcar nu știam de existența etapei practice.

- Te-au influențat Olimpiada?

Viața mea s-a schimbat radical. Am aflat despre multe alte olimpiade, în special m-am îndrăgostit de SBO. Ulterior, a arătat multe rezultate bune, unii au câștigat, datorită lui „Lomonosovskaya” au primit dreptul de a intra fără examene. În același timp, am câștigat olimpiade în istoria artei, la care încă respir inegal. Adevărat, nu era prieten cu tururi practice. În clasa a XI-a am ajuns totuși la etapa finală, dar Fortune nu a fost favorabil, iar de data aceasta nu am avut timp să completez matricea de răspuns a etapei teoretice. Dar acest lucru a făcut posibil să nu vă faceți prea multe griji cu privire la practic.

- Ai întâlnit multe olimpiade?

Da, mai cred că am avut mare noroc cu cercul semenilor mei, care mi-au lărgit foarte mult orizonturile. Cealaltă parte a olimpiadelor, pe lângă motivația de a studia subiectul mai armonios, a fost cunoașterea olimpiadelor. Deja la vremea respectivă, am observat că comunicarea orizontală este uneori mai utilă decât cea verticală - cu profesorii în cantonament.

- Cum ai intrat la universitate? Ai ales o facultate?

După clasa a XI-a, am intrat la Facultatea de Biologie a Universității de Stat din Moscova. Doar majoritatea camarazilor mei de atunci au făcut o alegere în favoarea FBB, dar aici rolul principal a fost jucat de faptul că nu am devenit câștigătorul All-Russian. Așa că ar trebui să dau un examen intern la matematică, iar în el, mai ales la școală - m-am îndrăgostit mult mai mult de cel superior - nu eram puternic. Și a fost o pregătire foarte slabă la școală (nu eram pregătiți pentru aproape toată partea C). La capitolul interese, chiar și atunci am bănuit că, până la urmă, poți ajunge la orice rezultat, indiferent de locul de admitere. Ulterior, s-a dovedit că există mulți absolvenți FBB care au trecut la biologie predominant umedă și invers - mulți bioinformaticieni buni au început ca amatori. Deși în acel moment mi se părea că contingentul de la facultatea de biologică va fi diferit de cel FBBshny. În asta cu siguranță m-am înșelat.

Știați?

Interesant

Știați?

Interesant

În tabăra Elefant și Girafă au loc schimbări în biochimie și biologie moleculară, unde școlari, împreună cu profesori cu experiență de la Universitatea de Stat din Moscova, organizează experimente și se pregătesc și pentru olimpiade.

© Intervievat de Reshetov Denis. Fotografiile au fost oferite cu amabilitate de Serghei Pirogov.

Biologie moleculara, o știință care își pune ca sarcină cunoașterea naturii fenomenelor vieții prin studierea obiectelor și sistemelor biologice la un nivel apropiat de nivelul molecular și, în unele cazuri, atingând această limită. Scopul final în acest caz este de a clarifica cum și în ce măsură manifestările caracteristice ale vieții, cum ar fi ereditatea, reproducerea propriului soi, biosinteza proteinelor, excitabilitatea, creșterea și dezvoltarea, stocarea și transmiterea informațiilor, transformările energetice, mobilitatea, etc., se datorează structurii, proprietăților și interacțiunii moleculelor substanțelor importante din punct de vedere biologic, în primul rând cele două clase principale de biopolimeri cu molecul mare - proteine ​​și acizi nucleici. O trăsătură distinctivă a lui M. b. - studiul fenomenelor vieții pe obiecte neînsuflețite sau care se caracterizează prin cele mai primitive manifestări ale vieții. Acestea sunt formațiuni biologice de la nivel celular și mai jos: organite subcelulare precum nuclei celulari izolați, mitocondrii, ribozomi, cromozomi, membrane celulare; în continuare - sisteme care se află la granița naturii animate și neînsuflețite - viruși, inclusiv bacteriofagi, și care se termină cu moleculele celor mai importante componente ale materiei vii - acizi nucleici și proteine.

Fundația pe care s-a dezvoltat M. a fost pusă de științe precum genetica, biochimia, fiziologia proceselor elementare etc. După originile dezvoltării sale, M. b. indisolubil legat de genetica moleculara, care continuă să fie o parte importantă

O trăsătură distinctivă a lui M. b. este tridimensionalitatea sa. Esența lui M. b. M. Perutz o vede în interpretarea funcţiilor biologice în termeni de structură moleculară. M. b. își propune să obțină răspunsuri la întrebarea „cum”, cunoașterea esenței rolului și participării întregii structuri a moleculei și la întrebările „de ce” și „de ce”, după ce am aflat, pe de o parte, relația între proprietățile moleculei (din nou, în primul rând proteine ​​și acizi nucleici) și funcțiile pe care le îndeplinește și, pe de altă parte, rolul acestor funcții individuale în complexul general de manifestări ale activității vitale.

Realizari cheie biologie moleculara. Iată o listă departe de a fi completă a acestor realizări: dezvăluirea structurii și mecanismului funcției biologice a ADN-ului, toate tipurile de ARN și ribozomi, dezvăluirea codului genetic; descoperirea transcripției inverse, adică sinteza ADN-ului pe un șablon de ARN; studiul mecanismelor de funcționare a pigmenților respiratori; descoperirea structurii tridimensionale și a rolului său funcțional în acțiunea enzimelor, a principiului sintezei matricei și a mecanismelor de biosinteză a proteinelor; dezvăluirea structurii virusurilor și a mecanismelor de replicare a acestora, structura primară și, parțial, spațială a anticorpilor; izolarea genelor individuale, chimică și apoi biologică (enzimatică) a genelor, inclusiv umane, în afara celulei (in vitro); transferul de gene de la un organism la altul, inclusiv în celulele umane; descifrarea rapidă a structurii chimice a unui număr tot mai mare de proteine ​​individuale, în principal enzime, precum și acizi nucleici; descoperirea fenomenelor de „auto-asamblare” a unor obiecte biologice de o complexitate din ce în ce mai mare, pornind de la molecule de acid nucleic și trecând la enzime multicomponente, virusuri, ribozomi etc.; elucidarea principiilor alosterice și a altor principii de bază de reglare a funcțiilor și proceselor biologice.

Probleme de biologie moleculară. Alături de sarcinile importante specificate M. ar. (cunoașterea legilor „recunoașterii”, auto-asamblare și integrare) direcția actuală a căutării științifice pentru viitorul apropiat este dezvoltarea unor metode care să permită descifrarea structurii, iar apoi organizarea tridimensională, spațială a nivelului molecular înalt. acizi nucleici. Toate cele mai importante metode, a căror utilizare a asigurat apariția și succesul lui M. b., au fost propuse și dezvoltate de către fizicieni (ultracentrifugarea, analiza prin difracție de raze X, microscopia electronică, rezonanța magnetică nucleară etc.). Aproape toate abordările experimentale fizice noi (de exemplu, utilizarea computerelor, sincrotronului sau bremsstrahlung, radiații, tehnologie laser și altele) deschid noi posibilități pentru un studiu aprofundat al problemelor lui M. b. Printre sarcini critice de natură practică, răspunsul la care se așteaptă de la M. b., în primul rând, este problema bazei moleculare a creșterii maligne, apoi - modalități de prevenire și poate depăși boli ereditare- Boli moleculare. De mare importanță va fi elucidarea bazei moleculare a catalizei biologice, adică acțiunea enzimelor. Printre cele mai importante direcții moderne ale lui M. b. ar trebui să includă dorința de a descifra mecanismele moleculare de acțiune ale hormonilor, substanțelor toxice și medicinale, precum și de a afla detaliile structurii moleculare și funcționării unor astfel de structuri celulare precum membrane biologice implicate în reglementarea pătrunderii şi transportului substanţelor. Goluri mai îndepărtate M. b. - cunoașterea naturii proceselor nervoase, a mecanismelor memoriei etc. Una dintre secțiunile importante emergente ale lui M. b. - așa-zisul. ingineria genetică, care își stabilește ca sarcină funcționarea intenționată a aparatului genetic (genom) al organismelor vii, începând cu microbi și inferior (monocelular) și terminând cu oamenii (în acest din urmă caz, în primul rând în scopul tratamentului radical al boli ereditare și corectarea defectelor genetice).

Cele mai importante direcții ale MB:

– Genetica moleculara– studiul organizării structurale și funcționale a aparatului genetic al celulei și mecanismul de implementare a informațiilor ereditare

– Virologie moleculară – studiul mecanismelor moleculare de interacțiune a virusurilor cu celulele

– Imunologie moleculară – studiul tiparelor reacțiilor imune ale organismului

– Biologia moleculară a dezvoltării – studiul apariției eterogenității celulelor în timpul dezvoltarea individuală organisme și specializări celulare

Obiecte principale de cercetare: Viruși (inclusiv bacteriofagi), Celule și structuri subcelulare, Macromolecule, Organisme multicelulare.