Какво изучава молекулярната биология. Професия молекулярен биолог. Установяване на генетичната роля на нуклеиновите киселини

Напредъкът в изследването на нуклеиновите киселини и биосинтезата на протеини доведе до създаването на редица методи с голямо практическо значение в медицината, селското стопанство и редица други индустрии.

След изучаването на генетичния код и основните принципи на съхранение и прилагане на наследствена информация, развитието на молекулярната биология спря, тъй като нямаше методи, които да позволяват манипулиране на гени, изолиране и промяна. Появата на тези методи се случи през 1970-1980-те години. Това даде мощен тласък за развитието на тази научна област, която е в разцвет и до днес. На първо място, тези методи се отнасят до получаване на отделни гени и тяхното въвеждане в клетки на други организми (молекулярно клониране и трансгенеза, PCR), както и методи за определяне на нуклеотидната последователност в гените (ДНК и РНК секвениране). Тези методи ще бъдат разгледани по-подробно по-долу. Ще започнем с най-простия основен метод, електрофорезата, и след това ще преминем към по-сложни методи.

ДНК ЕЛЕКТРОФОРЕЗА

Това е основният метод за работа с ДНК, който се използва заедно с почти всички други методи за изолиране на желаните молекули и анализ на резултатите. Гел електрофорезата се използва за разделяне на ДНК фрагменти по дължина. ДНК е киселина, нейните молекули съдържат остатъци от фосфорна киселина, които се отделят от протон и придобиват отрицателен заряд (фиг. 1).

Следователно в електрическо поле молекулите на ДНК се движат към анода - положително зареден електрод. Това се случва в електролитен разтвор, съдържащ йони-носители на заряд, поради което този разтвор провежда ток. За разделяне на фрагментите се използва плътен гел от полимери (агароза или полиакриламид). ДНК молекулите се „оплитат“ в него толкова повече, колкото са по-дълги и затова най-дългите молекули се движат най-бавно, а най-късите – най-бързо (фиг. 2). Преди или след електрофорезата, гелът се третира с багрила, които се свързват с ДНК и флуоресцират в ултравиолетова светлина, и се получава модел на ивици в гела (виж фиг. 3). За да се определят дължините на ДНК фрагменти в проба, те се сравняват с маркер, т.е. набор от фрагменти със стандартни дължини, депозирани паралелно върху един и същ гел (фиг. 4).

Най-важните инструменти за работа с ДНК са ензимите, които извършват ДНК трансформации в живи клетки: ДНК полимерази, ДНК лигази и рестрикционни ендонуклеази или рестрикционни ензими. ДНК полимеразаИзвършва се синтез на ДНК матрица, което позволява ДНК да бъде размножена в епруветка. ДНК лигазизашиват ДНК молекулите заедно или лекуват празнините в тях. Рестрикционни ендонуклеази, или рестриктази, изрязвайте ДНК молекулите според строго определени последователности, което ви позволява да изрязвате отделни фрагменти от общата маса на ДНК. Тези фрагменти могат в някои случаи да съдържат отделни гени.

рестриктази

Последователностите, разпознати от рестрикционните ензими, са симетрични и могат да се появят прекъсвания в средата на такава последователност или с изместване (на едно и също място в двете вериги на ДНК). Схема на действие различни видоверестриктаза е показано на фиг. 1. В първия случай се получават т. нар. "тъпи" краища, а във втория - "лепкави" краища. В случай на "лепкави" краища на дъното, веригата е по-къса от другата, образува се едноверижен участък със симетрична последователност, която е еднаква в двата образувани края.

Крайните последователности ще бъдат същите, когато която и да е ДНК се разцепи с даден рестрикционен ензим и могат да бъдат съединени отново, защото имат комплементарни последователности. Те могат да бъдат лигирани с ДНК лигаза, за да образуват единична молекула. Така е възможно да се комбинират фрагменти от две различни ДНК и да се получи т.нар рекомбинантна ДНК. Този подход се използва в метода на молекулярното клониране, което прави възможно получаването на отделни гени и въвеждането им в клетки, които могат да образуват протеина, кодиран в гена.

молекулярно клониране

Молекулярното клониране използва две ДНК молекули - вмъкване, съдържащо интересния ген, и вектор- ДНК действа като носител. Вложката се "зашива" във вектора с помощта на ензими, като се получава нова, рекомбинантна ДНК молекула, след което тази молекула се въвежда в клетките гостоприемници и тези клетки образуват колонии върху хранителна среда. Колонията е потомство на една клетка, т.е. клонинг, всички клетки на колонията са генетично идентични и съдържат една и съща рекомбинантна ДНК. Оттук и терминът "молекулярно клониране", тоест получаване на клонинг на клетки, съдържащ ДНК фрагмент, който ни интересува. След като се получат колониите, съдържащи вмъкването, което ни интересува, е възможно да се характеризира това вмъкване чрез различни методи, например да се определи точната му последователност. Клетките също могат да произвеждат протеина, кодиран от вмъкването, ако съдържа функционален ген.

Когато рекомбинантна молекула се въведе в клетките, настъпва генетичната трансформация на тези клетки. Трансформация- процес на усвояване от клетка на организъм на свободна ДНК молекула от околната среда и интегрирането й в генома, което води до появата в такава клетка на нови наследствени черти за нея, характерни за организма донор на ДНК. . Например, ако вмъкнатата молекула съдържа ген за резистентност към антибиотика ампицилин, тогава трансформираните бактерии ще растат в негово присъствие. Преди трансформацията ампицилинът причинява смъртта им, т.е. в трансформираните клетки се появява нов знак.

ВЕКТОРИ

Векторът трябва да има няколко свойства:

Първо, това е сравнително малка ДНК молекула, която лесно може да се манипулира.

На второ място, за да се запази и възпроизведе ДНК в клетката, тя трябва да съдържа определена последователност, която осигурява нейната репликация (началото на репликацията или началото на репликацията).

Трето, трябва да съдържа маркерен ген, което осигурява избора само на онези клетки, в които е влязъл векторът. Обикновено това са гени за резистентност към антибиотици – тогава в присъствието на антибиотик всички клетки, които не съдържат вектора, умират.

Генното клониране най-често се извършва в бактериални клетки, тъй като те са лесни за култивиране и се размножават бързо. В една бактериална клетка обикновено има една голяма кръгова ДНК молекула, дълга няколко милиона базови двойки, съдържаща всички гени, необходими на бактериите - бактериалната хромозома. Освен него в някои бактерии има малка (няколко хиляди базови двойки) кръгова ДНК, т.нар. плазмиди(фиг. 2). Те, подобно на основната ДНК, съдържат нуклеотидна последователност, която осигурява способността на ДНК да се репликира (ori). Плазмидите се репликират независимо от основната (хромозомна) ДНК, поради което присъстват в клетката в голям брой копия. Много от тези плазмиди носят гени за резистентност към антибиотици, което прави възможно разграничаването на клетките, носещи плазмида, от нормалните клетки. По-често се използват плазмиди, носещи два гена, придаващи резистентност към два антибиотика, като тетрациклин и амицилин. Съществуват прости методиизолиране на такава плазмидна ДНК, свободна от ДНК на основната хромозома на бактерията.

ЗНАЧЕНИЕТО НА ТРАНСГЕНЕЗАТА

Прехвърлянето на гени от един организъм в друг се нарича трансгенезаи такива модифицирани организми - трансгенен. Методът на генен трансфер в микробни клетки се използва за получаване на рекомбинантни протеинови препарати за медицината, по-специално човешки протеини, които не предизвикват имунно отхвърляне - интерферони, инсулин и други протеинови хормони, клетъчни растежни фактори, както и протеини за производството на ваксини. В по-сложни случаи, когато протеиновата модификация се извършва правилно само в еукариотни клетки, се използват трансгенни клетъчни култури или трансгенни животни, по-специално добитък (предимно кози), които отделят необходимите протеини в млякото или протеини се изолират от тяхната кръв . Така се получават антитела, фактори на кръвосъсирването и други протеини. получени чрез трансгенеза култивирани растениякоито са устойчиви на хербициди и вредители и имат други полезни свойства. Използвайки трансгенни микроорганизми за пречистване на отпадъчни води и борба със замърсяването, има дори трансгенни микроби, които могат да разграждат петрола. Освен това трансгенните технологии са незаменими в научно изследване- развитието на биологията днес е немислимо без рутинното използване на методи за модификация и генен трансфер.

технология за молекулярно клониране

вложки

За да се получи отделен ген от всеки организъм, цялата хромозомна ДНК се изолира от него и се разцепва с един или два рестрикционни ензима. Ензимите са подбрани така, че да не режат интересния за нас ген, а да правят прекъсвания по краищата му, а в плазмидната ДНК да правят едно прекъсване в един от гените за резистентност, например към ампицилин.

Процесът на молекулярно клониране включва следните стъпки:

Cut and stitch - конструиране на единична рекомбинантна молекула от инсерт и вектор.

Трансформацията е въвеждането на рекомбинантна молекула в клетките.

Избор - избор на клетки, които са получили вектор с вмъкване.

рязане и шиене

Плазмидната ДНК се третира със същите рестрикционни ензими и се превръща в линейна молекула, ако се избере такъв рестрикционен ензим, който въвежда 1 прекъсване в плазмида. В резултат на това в краищата на всички получени ДНК фрагменти се появяват еднакви лепкави краища. Тъй като температурата се понижава, тези краища се свързват произволно и се лигират с ДНК лигаза (виж Фиг. 3).

Получава се смес от кръгови ДНК с различен състав: някои от тях ще съдържат определена ДНК последователност от хромозомна ДНК, свързана с бактериална ДНК, други ще съдържат фрагменти от хромозомна ДНК, свързани заедно, а трети ще съдържат редуциран кръгъл плазмид или негов димер (фиг. 4).

трансформация

След това тази смес се извършва генетична трансформациябактерии, които не съдържат плазмиди. Трансформация- процес на усвояване от клетка на организъм на свободна ДНК молекула от околната среда и интегрирането й в генома, което води до появата в такава клетка на нови наследствени черти за нея, характерни за организма донор на ДНК. . Само един плазмид може да влезе и да се размножи във всяка клетка. Такива клетки се поставят върху твърда хранителна среда, съдържаща антибиотика тетрациклин. Клетките, които не са получили плазмида, няма да растат върху тази среда, а клетките, носещи плазмида, образуват колонии, всяка от които съдържа потомците само на една клетка, т.е. всички клетки в една колония носят един и същ плазмид (виж Фиг. 5).

Избор

След това задачата е да се изолират само клетките, в които е влязъл векторът с вмъкването, и да се разграничат от клетките, носещи само вектора без вмъкването или изобщо не носещи вектора. Този процес на избор на правилните клетки се нарича селекция. За това кандидатствайте селективни маркери- обикновено гени за резистентност към антибиотици във вектора, и селективна медиясъдържащи антибиотици или други селективни вещества.

В примера, който разглеждаме, клетки от колонии, отгледани в присъствието на ампицилин, се субкултивират върху две среди: първата съдържа ампицилин, а втората съдържа тетрациклин. Колониите, съдържащи само плазмида, ще растат и върху двете среди, докато колониите, съдържащи вмъкната хромозомна ДНК в плазмидите, няма да растат върху средата с тетрациклин (фиг. 5). Сред тях тези, които съдържат интересуващия ни ген, се избират по специални методи, отглеждат се в достатъчни количества и се изолира плазмидна ДНК. От него, използвайки същите рестриктази, които са били използвани за получаване на рекомбинантна ДНК, се изрязва отделният интересен ген. ДНК на този ген може да се използва за определяне на последователността на нуклеотидите, въвеждане във всеки организъм за получаване на нови свойства или синтезиране на желания протеин. Този метод за изолиране на ген се нарича молекулярно клониране.

ФЛУОРЕСЦЕНТНИ ПРОТЕИНИ

Много е удобно да се използват флуоресцентни протеини като маркерни гени в изследванията на еукариотни организми. Генът за първия флуоресцентен протеин, зелен флуоресцентен протеин (GFP)беше изолиран от медуза Aqeuorea victoria и въведен в различни моделни организми (виж Фиг. 6). През 2008 г. О. Шимомура, М. Чалфи и Р. Циен получиха Нобелова награда за откриването и приложението на този протеин.

След това са изолирани гените за други флуоресцентни протеини - червен, син, жълт. Тези гени са изкуствено модифицирани, за да произвеждат протеини с желаните свойства. Разнообразието от флуоресцентни протеини е показано на фиг. 7, която показва петриево блюдо с бактерии, съдържащи гени за различни флуоресцентни протеини.

приложение на флуоресцентни протеини

Генът на флуоресцентния протеин може да бъде слят с гена на всеки друг протеин, тогава по време на транслацията ще се образува един протеин - транслационен слят протеин, или синтез(слят протеин), който флуоресцира. По този начин е възможно да се изследва, например, локализацията (местоположението) на всякакви протеини, представляващи интерес в клетката, тяхното движение. Чрез експресиране на флуоресцентни протеини само в определени типове клетки е възможно да се маркират клетки от тези типове многоклетъчен организъм(виж фиг. 8 - мозък на мишка, в който отделните неврони имат различни цветове поради определена комбинация от флуоресцентни протеинови гени). Флуоресцентните протеини са незаменим инструмент в съвременната молекулярна биология.

PCR

Друг метод за получаване на гени се нарича полимеразна верижна реакция (PCR). Основава се на способността на ДНК полимеразите да завършват втората верига на ДНК по протежение на комплементарната верига, както се случва в клетките по време на репликацията на ДНК.

Началото на репликацията при този метод се дава от две малки части от ДНК, наречени семена,или грундове. Тези праймери са комплементарни на краищата на интересуващия ни ген върху две вериги на ДНК. Първо, хромозомната ДНК, от която трябва да се изолира генът, се смесва със семена и се нагрява до 99 ° C. Това води до разкъсване на водородни връзки и разминаване на ДНК вериги. След това температурата се понижава до 50-70 о С (в зависимост от дължината и последователността на семената). При тези условия, праймерите са прикрепени към комплементарни региони на хромозомна ДНК, образувайки правилна двойна спирала (виж Фиг. 9). След това се добавя смес от четирите нуклеотида, необходими за синтеза на ДНК и ДНК полимераза. Ензимът удължава праймерите, като изгражда двойноверижна ДНК от мястото на закрепване на праймерите, т.е. от краищата на ген до края на едноверижна хромозомна молекула.

Ако сега сместа се нагрее отново, хромозомните и новосинтезираните вериги ще се разпръснат. След охлаждане към тях отново ще се присъединят семена, които са взети в голям излишък (виж фиг. 10).

На новосинтезираните вериги те ще се присъединят не към края, от който е започнал първият синтез, а към противоположния, тъй като ДНК веригите са антипаралелни. Следователно, във втория цикъл на синтез, само последователността, съответстваща на гена, ще бъде завършена върху такива вериги (виж Фиг. 11).

Този метод използва ДНК полимераза от термофилни бактерии, които могат да издържат на кипене и работят при температури от 70-80 ° C, не е необходимо да се добавя всеки път, но е достатъчно да се добави в началото на експеримента. Чрез повтаряне на процедурите за нагряване и охлаждане в една и съща последователност, можем да удвоим броя на последователностите във всеки цикъл, ограничен в двата края от въведените семена (виж Фиг. 12).

След около 25 такива цикъла броят на копията на гена ще се увеличи повече от милион пъти. Такива количества могат лесно да бъдат отделени от хромозомната ДНК, въведена в епруветката и използвана за различни цели.

ДНК секвениране

Друго важно постижение е разработването на методи за определяне на последователността на нуклеотидите в ДНК - ДНК секвениране(от англ. sequence - последователност). За да направите това, е необходимо да получите чисти гени от друга ДНК, като използвате един от описаните методи. След това ДНК веригите се разделят чрез нагряване и към тях се добавя праймер, маркиран с радиоактивен фосфор или флуоресцентен етикет. Моля, обърнете внимание, че се взема едно семе, допълващо една верига. След това се добавят ДНК полимераза и смес от 4 нуклеотида. Такава смес се разделя на 4 части и към всяка се добавя един от нуклеотидите, модифициран така, че да не съдържа хидроксилна група на третия атом на дезоксирибозата. Ако такъв нуклеотид е включен в синтезираната ДНК верига, то неговото удължаване няма да може да продължи, т.к. полимеразата няма да има къде да прикрепи следващия нуклеотид. Следователно синтезата на ДНК след включването на такъв нуклеотид се прекъсва. Тези нуклеотиди, наречени дидезоксинуклеотиди, се добавят много по-малко от обикновено, така че прекъсването на веригата се случва само от време на време и във всяка верига на различни места. Резултатът е смес от вериги с различна дължина, всяка с един и същ нуклеотид в края. По този начин дължината на веригата съответства на номера на нуклеотида в изследваната последователност, например, ако имахме аденил дидезоксинуклеотид и получените вериги бяха дълги 2, 7 и 12 нуклеотида, тогава аденинът беше на втора, седма и дванадесета позиция в генът. Получената смес от вериги може лесно да бъде разделена по размер с помощта на електрофореза, а синтезираните вериги могат да бъдат идентифицирани чрез радиоактивност върху рентгенов филм (виж Фиг. 10).

Оказва се снимката, показана в долната част на снимката, наречена радиоавтограф. Придвижвайки се отдолу нагоре и четейки буквата над колоните на всяка зона, ще получим нуклеотидната последователност, показана на фигурата вдясно от автографа. Оказа се, че синтезът се спира не само от дидезоксинуклеотиди, но и от нуклеотиди, в които към третата позиция на захарта е прикрепена някаква химична група, например флуоресцентно багрило. Ако всеки нуклеотид е маркиран със собствено багрило, тогава зоните, получени чрез разделяне на синтезираните вериги, ще светят с различна светлина. Това дава възможност да се проведе реакцията в една епруветка едновременно за всички нуклеотиди и чрез разделяне на получените вериги по дължина да се идентифицират нуклеотидите по цвят (виж фиг. 11).

Подобни методи позволяват да се определят последователностите не само на отделни гени, но и да се разчитат цели геноми. Вече са разработени още по-бързи методи за определяне на нуклеотидни последователности в гени. Ако първият човешки геном беше дешифриран от голям международен консорциум по първия даден метод за 12 години, вторият, по втория, за три години, сега това може да стане за един месец. Това ви позволява да предвидите предразположеността на човек към много заболявания и да вземете мерки предварително, за да ги избегнете.

Развитието на биохимията, биофизиката, генетиката, цитохимията, много раздели на микробиологията и вирусологията около началото на 40-те години на ХХ век. тясно доведе до изучаването на жизнените явления на молекулярно ниво. Успехите, постигнати от тези науки, едновременно и от различни страни, доведоха до осъзнаването на факта, че на молекулярно ниво функционират основните контролни системи на тялото и че по-нататъшният прогрес на тези науки ще зависи от разкриването биологични функциимолекули, които изграждат телата на организмите, тяхното участие в синтеза и разпадането, взаимните трансформации и възпроизвеждането на съединения в клетката, както и обмена на енергия и информация, който се случва в този случай. Така на кръстовището на тези биологични дисциплини с химията и физиката възникна напълно нов клон - молекулярната биология.

За разлика от биохимията, вниманието на съвременната молекулярна биология е насочено главно към изучаването на структурата и функцията на най-важните класове биополимери - протеини и нуклеинови киселини, първите от които определят самата възможност за метаболитни реакции, а вторите - биосинтеза на специфични протеини. Следователно е ясно, че е невъзможно да се направи ясно разграничение между молекулярната биология и биохимията, съответните клонове на генетиката, микробиологията и вирусологията.

Появата на молекулярната биология е тясно свързана с разработването на нови изследователски методи, които вече бяха обсъдени в съответните глави. Наред с развитието на електронната микроскопия и други методи на микроскопската техника, методите за фракциониране на клетъчни елементи, разработени през 50-те години на миналия век, изиграха важна роля. Те се основават на подобрени методи за диференциално центрофугиране (A. Claude, 1954). По това време вече има доста надеждни методи за изолиране и фракциониране на биополимери. Това включва по-специално предложеното от А. Тиселиус (1937; Нобелова награда, 1948) методът за фракциониране на протеини с помощта на електрофореза, методи за изолиране и пречистване на нуклеинови киселини (E. Kay, A. Downs, M. Sevag, A. Mirsky и др.). В същото време в много лаборатории по света са разработени различни методи за хроматографски анализ (A. Martin и R. Sing, 1941; Нобелова награда, 1952), впоследствие значително подобрени.

Рентгеновият дифракционен анализ изигра безценна услуга при дешифрирането на структурата на биополимерите. Основните принципи на рентгеновия дифракционен анализ са разработени в King's College London University под ръководството на W. Bragg от група изследователи, включваща J. Bernal, A. Londsdale, W. Astbury, J. Robertson и др.

Особено внимание заслужава изследването на проф. Московски държавен университетА. Р. Кизел за биохимията на протоплазмата (1925 - 1929), които са от голямо значение за последващото формиране на молекулярната биология. Кизел нанесе удар на твърдо вкорененото схващане, че всяка протоплазма се основава на специално протеиново тяло - пластини, което уж определя всичките му най-важни структурни и функционални характеристики. Той показа, че плочите са протеин, който се намира само в миксомицетите, и то на определен етап от развитието, и че в протоплазмата не съществува постоянен компонент - единичен скелетен протеин. Така се стигна до изследването на проблема за структурата на протоплазмата и функционалната роля на протеините правилният начини има място за своето развитие. Изследванията на Кисел спечелиха световно признание, стимулирайки изучаването на химията съставни частиклетки.

Терминът "молекулярна биология", използван за първи път от английския кристалограф, професор от университета в Лийдс У. Астбъри, вероятно се появява в началото на 1940 г. (преди 1945 г.). Фундаменталните рентгенови дифракционни изследвания на протеини и ДНК, извършени от Астбъри през 30-те години на миналия век, послужиха като основа за последващото успешно дешифриране на вторичната структура на тези биополимери. През 1963 г. Дж. Бернал пише: "Паметник ще му бъде издигнат от цялата молекулярна биология - науката, която той назова и наистина основа" * , В литературата този термин се появява за първи път, може би, през 1946 г. в статията на W. Astbury „Прогрес на рентгеновия дифракционен анализ на органични и фибрилни съединения”, публикувана в английското списание „Nature” ** . В своята лекция на Харви Астбъри (1950) отбелязва: "Доволен съм, че терминът молекулярна биология сега се използва доста широко, въпреки че е малко вероятно аз да съм първият, който го е предложил. Хареса ми и отдавна се опитвам да го разпространя ” ***. Още през 1950 г. Астбъри е ясно, че молекулярната биология се занимава предимно със структурата и конформацията на макромолекулите, чието изследване е от решаващо значение за разбирането на функционирането на живите организми.

* (биогр. Мем. Колеги Рой. Soc, 1963, v. 9, 29.)

** (У. Т. Астбъри. Напредък на рентгеновия анализ на органични и влакнести структури.- Природа,. 1946 г., с. 157, 121.)

*** (У. Т. Астбъри. Приключения в Молекулярна биология. Томас Спрингфийлд, 1952 г., стр. 3.)

Молекулярната биология е изправена и е изправена всъщност пред същите задачи като биологията като цяло - познаването на същността на живота и неговите основни явления, по-специално като наследственост и променливост. Съвременната молекулярна биология е предназначена преди всичко да дешифрира структурата и функцията на гените, начините и механизмите на изпълнение генетична информацияорганизми на различни етапи от онтогенезата и на различни етапи от нейното четене. Той е предназначен да разкрие фините механизми на регулиране на генната активност и клетъчната диференциация, да изясни природата на мутагенезата и молекулярната основа на еволюционния процес.

Установяване на генетичната роля на нуклеиновите киселини

За развитието на молекулярната биология най-висока стойностимаше следните открития. През 1944 г. американските изследователи О. Ейвъри, К. Маклеод (Нобелова награда, 1923 г.) и М. Маккарти показват, че ДНК молекулите, изолирани от пневмококи, имат трансформираща активност. След хидролиза на тези ДНК чрез дезоксирибонуклеаза, тяхната трансформираща активност напълно изчезва. Така за първи път беше убедително доказано, че ДНК, а не протеинът, е надарен с генетични функции в клетката.

Честно казано, трябва да се отбележи, че феноменът на бактериалната трансформация е открит много по-рано от откритието на Ейвъри, Маклауд и Маккарти. През 1928 г. Ф. Грифит публикува статия, в която съобщава, че след добавяне на убити клетки от капсулиран вирулентен щам към невирулентни (некапсулирани) пневмококи, получената смес от клетки става фатална за мишки. Нещо повече, живите пневмококови клетки, изолирани от животни, заразени с тази смес, вече са вирулентни и притежават полизахаридна капсула. По този начин в този експеримент беше показано, че под въздействието на някои компоненти на убитите пневмококови клетки, некапсулираната форма на бактериите се превръща в капсулообразуваща вирулентна форма. Шестнадесет години по-късно Ейвъри, Маклауд и Маккарти заменят убитите цели пневмококови клетки с тяхната дезоксирибонуклеинова киселина в този експеримент и показват, че именно ДНК има трансформираща активност (виж също глави 7 и 25). Значението на това откритие е трудно да се надцени. То стимулира изследването на нуклеинови киселини в много лаборатории по света и принуждава учените да се съсредоточат върху ДНК.

Наред с откриването на Ейвъри, Маклауд и Маккарти, до началото на 50-те години доста голям бройпреки и косвени доказателства, че нуклеиновите киселини играят изключителна роля в живота и носят генетична функция. Това, по-специално, беше показано от естеството на локализацията на ДНК в клетката и данните на R. Vendrelli (1948), че съдържанието на ДНК на клетка е строго постоянно и корелира със степента на плоидност: в хаплоидните зародишни клетки ДНК е половината от това в диплоидните соматични клетки. Изразената метаболитна стабилност на ДНК също свидетелства в полза на генетичната роля на ДНК. До началото на 50-те години на миналия век се натрупаха много различни факти, които показват, че повечето от известните мутагенни фактори действат главно върху нуклеиновите киселини и по-специално върху ДНК (R. Hotchkiss, 1949; G. Ephrussi-Taylor, 1951; E. Freese, 1957 и други).

От особено значение за установяване на генетичната роля на нуклеиновите киселини беше изследването на различни фаги и вируси. През 1933 г. Д. Шлезингер открива ДНК в бактериофага на Escherichia coli. След изолирането на вируса на тютюневата мозайка (TMV) в кристално състояние от W. Stanley (1935 г., Нобелова награда, 1946 г.) започва нов етап в изследването на растителните вируси. През 1937 - 1938г. служители на Rothamsted Agricultural Station (Англия) F. Bowden и N. Peary показаха, че много изолирани от тях растителни вируси не са глобулини, а рибонуклеопротеини и съдържат нуклеинова киселина като задължителен компонент. В самото начало на 40-те години бяха публикувани трудовете на G. Schramm (1940), P. A. Agatov (1941), G. Miller и W. Stanley (1941), което показва, че забележима химическа модификация на протеиновия компонент не води до загуба на TMV инфекциозност. Това показва, че протеиновият компонент не може да бъде носител наследствени свойствавирус, както продължават да вярват много микробиолози. Убедителни доказателства в полза на генетичната роля на нуклеиновата киселина (РНК) в растителните вируси са получени през 1956 г. от Г. Шрам в Тюбинген (ФРГ) и Х. Френкел-Конрат в Калифорния (САЩ). Тези изследователи почти едновременно и независимо един от друг изолират РНК от TMV и показват, че тя, а не протеинът, има инфекциозност: в резултат на заразяване на тютюневите растения с тази РНК в тях се образуват и размножават нормални вирусни частици. Това означава, че РНК съдържа информация за синтеза и сглобяването на всички вирусни компоненти, включително вирусния протеин. През 1968 г. И. Г. Атабеков установи, че протеинът играе важна роля в самото заразяване на растенията - природата на протеина определя спектъра на растенията гостоприемници.

През 1957 г. Frenkel-Konrat за първи път извършва реконструкция на TMV от съставните му компоненти - РНК и протеин. Заедно с нормалните частици той получава смесени „хибриди“, в които РНК е от един щам, а протеинът от друг. Наследствеността на такива хибриди е напълно определена от РНК, а потомството на вирусите принадлежи на щама, чиято РНК е използвана за получаване на първоначалните смесени частици. По-късно експериментите на A. Gierer, G. Schuster и G. Schramm (1958) и G. Witman (1960 - 1966) показват, че химическата модификация на нуклеиновия компонент на TMV води до появата на различни мутанти на този вирус.

През 1970 г. Д. Балтимор и Г. Темин установяват, че трансферът на генетична информация може да се осъществи не само от ДНК към РНК, но и обратно. Те откриха в някои онкогенни РНК-съдържащи вируси (онкорнавируси) специален ензим, така наречената обратна транскриптаза, който е способен да синтезира комплементарна ДНК върху РНК вериги. Това голямо откритие направи възможно да се разбере механизмът на вмъкване на генетичната информация на РНК-съдържащите вируси в генома на гостоприемника и да се хвърли нов поглед върху природата на тяхното онкогенно действие.

Откриване на нуклеинови киселини и изследване на техните свойства

Терминът нуклеинови киселини е въведен от немския биохимик R. Altman през 1889 г., след като тези съединения са открити през 1869 г. от швейцарския лекар F. Miescher. Мишер екстрахира гнойните клетки с разредена солна киселина в продължение на няколко седмици и получава почти чист ядрен материал в остатъка. Той смята този материал за характерно „вещество на клетъчните ядра и го нарича нуклеин. По свойствата си нуклеинът се различава рязко от протеините: той е по-киселинен, не съдържа сяра, но съдържа много фосфор, лесно се разтваря в основи, но не се разтварят в разредени киселини.

Мишър изпраща резултатите от своите наблюдения върху нуклеина на Ф. Гопе-Сейлер за публикуване в списание. Описаното от него вещество беше толкова необичайно (по това време от всички биологични фосфорсъдържащи съединения беше известен само лецитинът), че Гопе-Сейлер не повярва на експериментите на Мишер, върна му ръкописа и инструктира служителите си Н. Плош и Н. Любавин да проверете заключенията му върху друг материал. Работата на Miescher „За химичния състав на гнойните клетки“ е публикувана две години по-късно (1871). В същото време бяха публикувани трудовете на Goppe-Seyler и неговите сътрудници за състава на гнойни клетки, еритроцити на птици, змии и други клетки. През следващите три години нуклеинът е изолиран от животински клетки и дрожди.

В работата си Miescher отбеляза, че подробното изследване на различни нуклеини може да доведе до установяване на разлики между тях, като по този начин предвижда идеята за специфичност на нуклеиновите киселини. Докато изучава млякото от сьомга, Мишер установява, че нуклеинът в тях е под формата на сол и е свързан с основния протеин, който той нарича протамин.

През 1879 г. А. Косел започва да изучава нуклеини в лабораторията на Гопе-Сейлер. През 1881 г. той изолира хипоксантин от нуклеин, но по това време все още се съмняваше в произхода на тази основа и вярваше, че хипоксантинът може да бъде продукт на разграждане на протеини. През 1891 г. сред продуктите на нуклеинова хидролиза Косел открива аденин, гуанин, фосфорна киселина и друго вещество със свойствата на захар. За изследвания върху химията на нуклеиновите киселини Косел получава Нобелова награда през 1910 г.

По-нататъшният напредък в дешифрирането на структурата на нуклеиновите киселини е свързан с изследванията на П. Левин и колеги (1911 - 1934). През 1911 г. P. Levin и V. Jacobs идентифицират въглехидратния компонент на аденозин и гуанозин; те откриха, че тези нуклеозиди съдържат D-рибоза. През 1930 г. Левин показа, че въглехидратният компонент на дезоксирибонуклеозидите е 2-дезокси-D-рибоза. От работата му стана известно, че нуклеиновите киселини са изградени от нуклеотиди, т.е. фосфорилирани нуклеозиди. Левин вярва, че основният тип връзка в нуклеиновите киселини (РНК) е 2", 5" фосфодиестерна връзка. Това схващане се оказа погрешно. Благодарение на работата на английския химик А. Тод (Нобелова награда, 1957 г.) и неговите сътрудници, както и на английските биохимици Р. Маркъм и Дж. Смит, в началото на 50-те години стана известно, че основният тип връзка в РНК е 3", 5" - фосфодиестерна връзка.

Люин показа, че различните нуклеинови киселини могат да се различават по естеството на въглехидратния компонент: някои от тях съдържат захарта дезоксирибоза, докато други съдържат рибоза. В допълнение, тези два вида нуклеинови киселини се различават по естеството на една от базите: нуклеиновите киселини от тип пентоза съдържат урацил, а нуклеиновите киселини от тип дезоксипентоза съдържат тимин. Дезоксипентозната нуклеинова киселина (в съвременната терминология дезоксирибонуклеинова киселина - ДНК) обикновено се изолира лесно в големи количества от тимуса (сладката жлеза) на телетата. Затова се нарича тимонуклеинова киселина. Източникът на нуклеинова киселина от пентозен тип (РНК) е главно дрожди и пшеничен зародиш. Този тип често се нарича нуклеинова киселина на дрожди.

В началото на 30-те години на миналия век идеята, че растителните клетки се характеризират с нуклеинова киселина от дрожден тип, беше доста здраво вкоренена, докато тимонуклеиновата киселина беше характерна само за ядрата на животинските клетки. Двата типа нуклеинови киселини, РНК и ДНК, тогава се наричат ​​съответно растителни и животински нуклеинови киселини. Въпреки това, както показват ранните изследвания на А. Н. Белозерски, такова разделение на нуклеиновите киселини е неоправдано. През 1934 г. Белозерски за първи път открива тимонуклеинова киселина в растителни клетки: от грахови кълнове той изолира и идентифицира тимин-пиримидиновата база, която е характерна за ДНК. След това открива тимин в други растения (семена от соя, боб). През 1936 г. А. Н. Белозерски и И. И. Дубровская изолират препаративно ДНК от разсад от конски кестен. В допълнение, серия от изследвания, проведени в Англия през 40-те години на миналия век от D. Davidson и сътрудници, убедително показаха, че растителната нуклеинова киселина (РНК) се съдържа в много животински клетки.

Широкото използване на цитохимичната реакция за ДНК, разработена от R. Felgen и G. Rosenbeck (1924) и реакцията на J. Brachet (1944) за РНК, направи възможно бързото и недвусмислено решаване на въпроса за преференциалната локализация на тези нуклеинови киселини в клетката. Оказа се, че ДНК е концентрирана в ядрото, докато РНК е концентрирана предимно в цитоплазмата. По-късно беше установено, че РНК се съдържа както в цитоплазмата, така и в ядрото и освен това беше идентифицирана цитоплазмената ДНК.

Що се отнася до въпроса за първичната структура на нуклеиновите киселини, до средата на 40-те години идеята на П. Левин е твърдо установена в науката, според която всички нуклеинови киселини са изградени според един и същи тип и се състоят от един и същ така наречен тетрануклеотид блокове. Всеки от тези блокове, според Люин, съдържа четири различни нуклеотида. Тетрануклеотидната теория за структурата на нуклеиновите киселини до голяма степен лиши тези биополимери от специфичност. Ето защо не е изненадващо, че по това време всички специфики на живите същества са били свързани само с протеини, природата на мономерите на които е много по-разнообразна (20 аминокиселини).

Първата празнина в теорията за тетрануклеотидната структура на нуклеиновите киселини е направена от аналитичните данни на английския химик J. Gouland (1945 - 1947). При определяне на състава на нуклеиновите киселини чрез азотната основа той не получава еквимоларно съотношение на базите, както би трябвало да бъде според теорията на Левин. И накрая, тетрануклеотидната теория за структурата на нуклеиновите киселини се срина в резултат на изследванията на Е. Чаргаф и неговите сътрудници (1949 - 1951). За да отдели базите, освободени от ДНК в резултат на нейната киселинна хидролиза, Чаргаф използва хартиена хроматография. Всяка от тези бази беше точно определена спектрофотометрично. Чаргаф забелязва значителни отклонения от еквимоларното съотношение на базите в ДНК от различен произход и за първи път категорично заявява, че ДНК има изразена видова специфичност. Това сложи край на хегемонията на концепцията за протеиновата специфичност в живата клетка. Анализирайки ДНК от различен произход, Чаргаф открива и формулира уникални модели на състава на ДНК, които навлизат в науката под името правила на Чаргаф. Съгласно тези правила във всички ДНК, независимо от произхода, количеството аденин е равно на количеството тимин (A = T), количеството гуанин е равно на количеството цитозин (G = C), количеството на пурини е равно на количеството пиримидини (G + A = C + T), количеството бази с 6-амино групи е равно на броя на базите с 6-кето групи (A + C = G + T). В същото време, въпреки толкова строги количествени съответствия, ДНК на различните видове се различава в стойността на съотношението A + T: G + C. В някои ДНК количеството на гуанин и цитозин преобладава над количеството на аденин и тимин (Чаргаф нарича тези ДНК GC-тип ДНК); други ДНК съдържат повече аденин и тимин, отколкото гуанин и цитозин (тези ДНК се наричат ​​АТ-тип ДНК). Получените от Чаргаф данни за състава на ДНК изиграха изключителна роля в молекулярната биология. Именно те са в основата на откритието на структурата на ДНК, направено през 1953 г. от Дж. Уотсън и Ф. Крик.

През 1938 г. У. Астбъри и Ф. Бел, използвайки рентгенов дифракционен анализ, показаха, че базовите равнини в ДНК трябва да са перпендикулярни на дългата ос на молекулата и да приличат, така да се каже, на купчина плочи, разположени отгоре един от друг. С усъвършенстване на техниката на рентгеновия дифракционен анализ, към 1952 – 1953г. натрупана информация, която позволява да се прецени дължината на отделните връзки и ъглите на наклон. Това направи възможно да се представи с най-голяма вероятност природата на ориентацията на пръстените на пентозните остатъци в захарно-фосфатния скелет на молекулата на ДНК. През 1952 г. С. Фарберг предлага два спекулативни модела на ДНК, които представляват едноверижна молекула, нагъната или усукана върху себе си. Не по-малко спекулативен модел на структурата на ДНК е предложен през 1953 г. от Л. Полинг (носител на Нобелова награда за 1954 г.) и Р. Кори. В този модел три усукани нишки на ДНК образуват дълга спирала, чието ядро ​​е представено от фосфатни групи, а базите са разположени извън нея. До 1953 г. М. Уилкинс и Р. Франклин получават по-ясни рентгенови дифракционни модели на ДНК. Техният анализ показа пълния провал на моделите на Фарберг, Полинг и Кори. Използвайки данните на Chargaff, сравнявайки различни комбинации от молекулярни модели на отделни мономери и данни от рентгенова дифракция, J. Watson и F. Crick през 1953 г. стигат до извода, че молекулата на ДНК трябва да бъде двуверижна спирала. Правилата на Чаргаф силно ограничават броя на възможните подредени комбинации от бази в предложения ДНК модел; те предложиха на Уотсън и Крик, че трябва да има специфично сдвояване на основите в молекулата на ДНК - аденин с тимин и гуанин с цитозин. С други думи, аденинът в едната верига на ДНК винаги стриктно съответства на тимина в другата верига, а гуанинът в едната верига задължително съответства на цитозина в другата. По този начин Уотсън и Крик са първите, които формулират изключително важния принцип на комплементарната структура на ДНК, според който една ДНК верига допълва друга, т.е. базовата последователност на една верига еднозначно определя базовата последователност в другата (комплементарна) верига . Стана очевидно, че вече в самата структура на ДНК се крие потенциалът за нейното точно възпроизвеждане. Този модел на ДНК структура в момента е общоприет. Крик, Уотсън и Уилкинс са удостоени с Нобелова награда през 1962 г. за дешифрирането на структурата на ДНК.

Трябва да се отбележи, че идеята за механизъм за точно възпроизвеждане на макромолекули и предаване на наследствена информация се заражда у нас. През 1927 г. Н. К. Колцов предполага, че по време на клетъчното възпроизвеждане възпроизвеждането на молекулите става чрез точно автокаталитично възпроизвеждане на съществуващите родителски молекули. Вярно, по това време Колцов надари това свойство не с ДНК молекули, а с молекули от протеинова природа, чието функционално значение тогава беше неизвестно. Независимо от това, самата идея за автокаталитично възпроизвеждане на макромолекули и механизмът на предаване на наследствените свойства се оказаха пророчески: това стана водеща идея на съвременната молекулярна биология.

Проведено в лабораторията на А. Н. Белозерски от А. С. Спирин, Г. Н. Зайцева, Б. Ф. Ванюшин, С. О. Урисон, А. С. Антонов и други различни организми напълно потвърждават моделите, открити от Чаргаф, и пълното съответствие с молекулярния модел на структурата на ДНК, предложен от Уотсън и Крик. Тези изследвания показват, че ДНК на различни бактерии, гъбички, водорасли, актиномицети, висши растения, безгръбначните и гръбначните имат композиционна специфика. Разликите в състава (съдържанието на AT-базови двойки) са особено изразени при микроорганизмите, което се оказва важна таксономична характеристика. При висшите растения и животни видовите вариации в състава на ДНК са много по-слабо изразени. Но това не означава, че тяхната ДНК е по-малко специфична. В допълнение към състава на базите, специфичността до голяма степен се определя от тяхната последователност в ДНК веригите.

Наред с обичайните бази, в ДНК и РНК са открити допълнителни азотни бази. Така G. White (1950) открива 5-метилцитозин в ДНК на растения и животни, а D. Dunn и J. Smith (1958) откриват метилиран аденин в някои ДНК. Дълго време метилцитозинът се смяташе за отличителен белег на генетичния материал на висшите организми. През 1968 г. А. Н. Белозерски, Б. Ф. Ванюшин и Н. А. Кокурина установяват, че той може да бъде открит и в ДНК на бактериите.

През 1964 г. M. Gold и J. Hurwitz откриват нов клас ензими, които извършват естествената модификация на ДНК - нейното метилиране. След това откритие стана ясно, че минорни (съдържащи се в малки количества) бази възникват вече върху готовата полинуклеотидна верига на ДНК в резултат на специфично метилиране на цитозинови и аденинови остатъци в специални последователности. По-специално, според Б. Ф. Ванюшин, Я. И. Бурянов и А. Н. Белозерски (1969), метилирането на аденин в ДНК на Е. coli може да се появи в терминиращите кодони. Според A. N. Belozersky и колеги (1968 - 1970), както и M. Meselson (САЩ) и V. Arber (Швейцария) (1965 - 1969), метилирането придава уникални индивидуални характеристики на ДНК молекулите и в комбинация с действието на специфични нуклеази, е част от сложен механизъм, който контролира синтеза на ДНК в клетката. С други думи, естеството на метилиране на определена ДНК предопределя въпроса дали тя може да се размножава в дадена клетка.

Почти по същото време започва изолирането и интензивното изследване на ДНК метилазите и рестрикционните ендонуклеази; през 1969-1975г са установени нуклеотидните последователности, разпознавани в ДНК от някои от тези ензими (X. Boyer, X. Smith, S. Lynn, K. Murray). Когато различни ДНК се хидролизират от рестрикционен ензим, доста големи фрагменти с еднакви "лепкави" краища се разцепват. Това дава възможност не само да се анализира структурата на гените, както се прави при малките вируси (D. Nathans, S. Adler, 1973 - 1975), но и да се конструират различни геноми. С откриването на тези специфични рестрикционни ензими, генното инженерство се превърна в осезаема реалност. Вградените в малка плазмидна ДНК гени с различен произход вече лесно се въвеждат различни клетки. Така беше получен нов тип биологично активни плазмиди, които дават резистентност към определени антибиотици (S. Cohen, 1973), рибозомни гени на жаба и Drosophila бяха въведени в плазмидите на Escherichia coli (J. Morrow, 1974; X. Boyer, D Хогнес, Р. Дейвис, 1974 - 1975). По този начин се откриват реални начини за получаване на принципно нови организми чрез въвеждане и интегриране на различни гени в техния генофонд. Това откритие може да бъде насочено в полза на цялото човечество.

През 1952 г. G. White и S. Cohen откриват, че ДНК на Т-четните фаги съдържа необичайна основа, 5-хидроксиметилцитозин. По-късно, от трудовете на E. Volkin и R. Sinsheimer (1954) и Cohen (1956), става известно, че хидроксиметилцитозиновите остатъци могат да бъдат напълно или частично глюкозидирани, в резултат на което фаговата ДНК молекула е защитена от хидролитично действие на нуклеази.

В началото на 50-те години на миналия век от трудовете на Д. Дън и Дж. Смит (Англия), С. Заменхоф (САЩ) и А. Вакер (Германия) стана известно, че много изкуствени базови аналози могат да бъдат включени в ДНК, понякога замествайки до 50% тимин. По правило тези замествания водят до грешки в репликацията, транскрипцията и транслацията на ДНК и до появата на мутанти. Така J. Marmur (1962) установи, че ДНК на някои фаги съдържа оксиметилурацил вместо тимин. През 1963 г. И. Такахаши и Дж. Мармур откриват, че ДНК на един от фагите съдържа урацил вместо тимин. Така се срина друг принцип, според който нуклеиновите киселини преди това бяха разделени. От трудовете на П. Левин се смята, че отличителен белегДНК е тимин, а РНК е урацил. Стана ясно, че този знак не винаги е надежден и основната разлика в химичната природа на двата вида нуклеинови киселини, както изглежда днес, е само природата на въглехидратния компонент.

При изследването на фагите са разкрити много необичайни характеристики на организацията на нуклеиновите киселини. От 1953 г. се смята, че всички ДНК са двуверижни линейни молекули, докато РНК е само едноверижна. Тази позиция е значително разклатена през 1961 г., когато R. Sinsheimer открива, че ДНК на фага φ X 174 е представена от едноверижна кръгова молекула. По-късно обаче се оказа, че в тази форма тази ДНК съществува само във вегетативна фагова частица, а репликативната форма на ДНК на този фаг също е двуверижна. Освен това се оказа доста неочаквано, че РНК на някои вируси може да бъде двуверижна. Този нов тип макромолекулна организация на РНК е открита през 1962 г. от P. Gomatos, I. Tamm и други изследователи в някои животински вируси и в туморен вирус на растителна рана. Наскоро В. И. Агол и А. А. Богданов (1970) установиха, че в допълнение към линейните РНК молекули има и затворени или циклични молекули. Те откриха циклична двойноверижна РНК, по-специално във вируса на енцефаломиелокардит. Благодарение на трудовете на X. Deveaux, L. Tinoko, T. I. Tikhonenko, E. I. Budovsky и други (1960 - 1974) станаха известни основните характеристики на организацията (сгъването) на генетичния материал в бактериофагите.

В края на 50-те години на миналия век американският учен П. Доти установява, че нагряването причинява денатурация на ДНК, което е придружено от разкъсване на водородните връзки между базовите двойки и разделяне на комплементарни вериги. Този процес има характер на фазов преход "спирала-намотка" и наподобява стапянето на кристали. Следователно Доти нарече процеса на термична денатурация на ДНК стапяне на ДНК. При бавно охлаждане настъпва ренатурация на молекули, т.е. повторно обединяване на допълващи се половини.

Принципът на ренатурация през 1960 г. е използван от J. Marmur и K. Schildkraut за определяне на степента на "хибридизация" на ДНК на различни микроорганизми. Впоследствие Е. Болтън и Б. Маккарти подобриха тази техника, като предложиха метода на т. нар. ДНК-агар колони. Този метод се оказа незаменим при изследване на степента на хомология на нуклеотидната последователност на различни ДНК и изясняване на генетичната връзка на различни организми. Денатурацията на ДНК, открита от Доти в комбинация с хроматография върху метилиран албумин, описана от J. Mandel и A. Hershey * (1960) и центрофугиране в градиент на плътност (методът е разработен през 1957 г. от M. Meselson, F. Stahl и D. Winograd) се използва широко за разделяне, изолиране и анализ на отделни комплементарни ДНК вериги. Например, W. Shibalsky (САЩ), използвайки тези техники за разделяне на ДНК на ламбда фага, показа през 1967 - 1969 г., че и двете фагови вериги са генетично активен, а не един, както се смяташе за (S. Spiegelman, 1961). Трябва да се отбележи, че за първи път идеята за генетичното значение на двете ДНК вериги на ламбда фага е изразена в СССР от SE Bresler (1961).

* (За работата си върху генетиката на бактериите и вирусите А. Хърши, заедно с М. Делбрюк и С. Лурия, са удостоени с Нобелова награда през 1969 г.)

За да се разбере организацията и функционалната активност на генома, определянето на нуклеотидната последователност на ДНК е от първостепенно значение. Търсенето на методи за такова определяне се извършва в много лаборатории по света. От края на 50-те години на миналия век М. Биър и неговите сътрудници се опитват да установят последователността на ДНК с помощта на електронна микроскопия в САЩ, но досега безуспешно. В началото на 50-те години на миналия век, от първите трудове на Sinsheimer, Chargaff и други изследователи върху ензимното разграждане на ДНК, стана известно, че различните нуклеотиди в молекулата на ДНК са разпределени, макар и не произволно, а неравномерно. Според английския химик С. Бартън (1961) пиримидините (повече от 70%) са концентрирани главно под формата на съответните блокове. A. L. Mazin и B. F. Vanyushin (1968 - 1969) установяват, че различните ДНК имат различна степен на пиримидинова кохезия и че в ДНК на животински организми тя се увеличава значително, когато се движи от по-ниско към по-високо. По този начин еволюцията на организмите се отразява и в структурата на техните геноми. Ето защо за разбирането на еволюционния процес като цяло сравнителното изследване на структурата на нуклеиновите киселини е от особено значение. Анализът на структурата на биологично важни полимери и на първо място на ДНК е изключително важен за решаването на много специфични проблеми на филогенетиката и таксономията.

Интересно е да се отбележи, че английският физиолог Е. Ланкестър, който изучава хемоглобините на мекотелите, предусеща идеите на молекулярната биология точно преди 100 години, пише: „Химичните различия на различните видове и родове животни и растения имат еднакви важностда се изясни историята на техния произход, както и разликите във формата им. Ако можехме ясно да установим разликите в молекулярната организация и функционирането на организмите, бихме могли да разберем произхода и еволюцията на различните организми много по-добре, отколкото въз основа на морфологични наблюдения "*. Значението на биохимичните изследвания за систематиката също беше подчертава В. Л. Комаров, който пише, че „в сърцето на всички дори чисти морфологични особености, въз основа на които класифицираме и установяваме видовете, лежат именно биохимичните различия“ ** .

* (Е. Р. Ланкестър. Uber das Vorcommen von Hemoglobin in den Muskeln der Mollusken und die Verbreitung desselben in den lebendigen Organismen.- "Pfluger" s Archiv fur die gesammte Physiol., 1871, Bd 4, 319.)

** (В. Л. Комаров. Избрани произведения, т. 1. М.-Л., Издателство на Академията на науките на СССР, 1945 г., стр. 331.)

А. В. Благовещенски и С. Л. Иванов още през 20-те години на миналия век направиха първите стъпки у нас за изясняване на някои въпроси на еволюцията и систематиката на организмите въз основа на сравнителен анализ на техния биохимичен състав (виж глава 2). Сравнителен анализструктурата на протеините и нуклеиновите киселини сега става все по-осезаем инструмент за таксономистите (виж Глава 21). Този метод на молекулярната биология позволява не само да се изясни позицията на отделните видове в системата, но също така налага да се хвърли нов поглед върху самите принципи на класификация на организмите, а понякога и да се преразгледа цялата система като цяло, т.к. се случи, например, със систематиката на микроорганизмите. Несъмнено в бъдеще анализът на структурата на генома ще заеме централно място в хемосистематиката на организмите.

От голямо значение за развитието на молекулярната биология беше дешифрирането на механизмите на репликация и транскрипция на ДНК (виж глава 24).

Биосинтеза на протеини

Важна промяна в решаването на проблема с биосинтезата на протеини е свързана с напредъка в изследването на нуклеиновите киселини. През 1941 г. T. Kasperson (Швеция) и през 1942 г. J. Brachet (Белгия) обръщат внимание на факта, че тъканите с активен протеинов синтез съдържат повишено количество РНК. Те заключават, че рибонуклеиновите киселини играят решаваща роля в синтеза на протеини. През 1953 г. Е. Гейл и Д. Фокс изглежда са получили пряко доказателство за прякото участие на РНК в биосинтезата на протеини: според техните данни рибонуклеазата значително потиска включването на аминокиселини в лизатите на бактериалните клетки. Подобни данни са получени от V. Olfri, M. Delhi и A. Mirsky (1953) върху чернодробни хомогенати. По-късно Е. Гейл изостави правилната идея, която беше изразил за водещата роля на РНК в протеиновия синтез, погрешно вярвайки, че активирането протеинов синтезв безклетъчна система се е случило под въздействието на някакво друго вещество с неизвестна природа. През 1954 г. P. Zamechnik, D. Littlefield, R. B. Khesin-Lurie и други установяват, че най-активното включване на аминокиселини се случва в богатите на РНК фракции на субклетъчни частици - микрозоми. P. Zamechnik и E. Keller (1953 - 1954) установяват, че включването на аминокиселини се засилва значително в присъствието на супернатанта при условия на регенерация на АТФ. P. Sikevitz (1952) и M. Hoagland (1956) изолират протеинова фракция (pH 5 фракция) от супернатанта, която е отговорна за рязкото стимулиране на включването на аминокиселини в микрозомите. Заедно с протеините, в супернатантата беше открит специален клас РНК с ниско молекулно тегло, сега наречени трансферни РНК (тРНК). През 1958 г. Hoagland и Zamechnik, както и P. Berg, R. Sweet и F. Allen и много други изследователи установиха, че всяка аминокиселина изисква свой собствен специален ензим, ATP и специфична tRNA, за да се активира. Стана ясно, че tRNAs изпълняват изключително функцията на адаптери, т.е. устройства, които намират място върху нуклеиновата матрица (mRNA) за съответната аминокиселина в новопоявилата се протеинова молекула. Тези изследвания напълно потвърждават адапторната хипотеза на Ф. Крик (1957), която предвижда наличието в клетката на полинуклеотидни адаптери, необходими за правилното подреждане на аминокиселинните остатъци на синтезирания протеин върху нуклеиновата матрица. Много по-късно френският учен Ф. Чапвил (1962 г.) в лабораторията на Ф. Липман (Нобелова награда, 1953 г.) в САЩ много находчиво и недвусмислено показва, че мястото на аминокиселината в синтезираната протеинова молекула се определя изцяло от специфична тРНК, към която е прикрепен. Адаптерната хипотеза на Крик е разработена от Хогланд и Замечник.

До 1958 г. станаха известни следните основни етапи на протеиновия синтез: 1) активиране на аминокиселина от специфичен ензим от "рН 5 фракция" в присъствието на АТФ с образуването на аминоацил аденилат; 2) прикрепване на активирана аминокиселина към специфична tRNA с освобождаване на аденозин монофосфат (AMP); 3) свързване на аминоацил-тРНК (тРНК, заредена с аминокиселина) към микрозомите и включване на аминокиселини в протеин с освобождаване на тРНК. Hoagland (1958) отбелязва, че гуанозин трифосфат (GTP) е необходим в последния етап от синтеза на протеини.

Трансфер РНК и генен синтез

След откриването на тРНК започват активни търсения за тяхното фракциониране и определяне на нуклеотидната последователност. Най-голям успех постига американският биохимик Р. Холи. През 1965 г. той установява структурата на аланиновата тРНК от дрожди. Използвайки рибонуклеази (гуанил РНКаза и панкреатична РНКаза), Холи разделя молекулата на нуклеиновата киселина на няколко фрагмента, определя нуклеотидната последователност във всеки от тях поотделно и след това реконструира последователността на цялата аланинова тРНК молекула. Този начин за анализ на нуклеотидната последователност се нарича блоков метод. Заслугата на Холи се състоеше главно в това, че той се научи да разделя молекулата на РНК не само на малки парчета, както мнозина преди него, но и на големи фрагменти (четвъртини и половини). Това му дава възможност правилно да сглоби отделни малки парчета заедно и по този начин да пресъздаде пълната нуклеотидна последователност на цялата молекула tRNA (Нобелова награда, 1968 г.).

Тази техника веднага беше приета от много лаборатории по света. През следващите две години в СССР и в чужбина той беше дешифриран първична структураняколко тРНК наведнъж. А. А. Баев (1967) и сътрудници за първи път установяват нуклеотидната последователност в тРНК на валин от дрожди. Към днешна дата са изследвани повече от дузина различни отделни тРНК. Своеобразен рекорд в определянето на нуклеотидната последователност е поставен в Кеймбридж от Ф. Сенгер и Г. Браунли. Тези изследователи разработиха изненадващо елегантен метод за разделяне на олигонуклеотиди и секвениране на така наречената 5 S (рибозомна) РНК от клетки на E. coli (1968). Тази РНК се състои от 120 нуклеотидни остатъка и, за разлика от tRNA, не съдържа допълнителни второстепенни бази, които значително улесняват анализа на нуклеотидната последователност, служейки като уникални ориентири за отделните фрагменти на молекулата. Понастоящем, благодарение на използването на метода Sanger и Brownlee, работата по изучаването на последователността на дългите рибозомни РНК и някои вирусни РНК успешно се развива в лабораторията на J. Ebel (Франция) и други изследователи.

А. А. Баев и колеги (1967) установиха, че валиновата тРНК, нарязана наполовина, възстановява своята макромолекулна структура в разтвор и въпреки дефекта в първичната структура има функционалната активност на оригиналната (нативна) молекула. Този подход - реконструкцията на изрязана макромолекула след отстраняване на определени фрагменти - се оказа много обещаващ. Сега се използва широко за изясняване на функционалната роля на отделни участъци от определени тРНК.

IN последните годиниГолям успех е постигнат в получаването на кристални препарати от отделни тРНК. Много тРНК вече са кристализирани в няколко лаборатории в САЩ и Англия. Това направи възможно изследването на структурата на tRNA с помощта на рентгенов дифракционен анализ. През 1970 г. Р. Бок представя първите рентгенови модели и триизмерни модели на няколко тРНК, които е създал в университета на Уисконсин. Тези модели помагат да се определи локализацията на отделните функционално активни места в тРНК и да се разберат основните принципи на функциониране на тези молекули.

От първостепенно значение за разкриването на механизма на синтеза на протеини и решаването на проблема за спецификата на този процес беше дешифрирането на природата на генетичния код (виж Глава 24), което без преувеличение може да се счита за водещо постижение на естествените наука през 20 век.

Откриването на Р. Холи за първичната структура на tRNA даде тласък на работата на G. Korana * (САЩ) върху синтеза на олигонуклеотиди и ги насочи към синтеза на специфична биологична структура - ДНК молекула, кодираща аланинова tRNA. Първите стъпки в химическия синтез на къси олигонуклеотиди, направени от Корана преди почти 15 години, завършиха през 1970 г. с първия генен синтез. Коран и неговите сътрудници първи химически синтезират къси фрагменти от 8-12 нуклеотидни остатъка от отделни нуклеотиди. Тези фрагменти с дадена нуклеотидна последователност образуват спонтанно двойноверижни комплементарни части с припокриване от 4–5 нуклеотида. След това тези готови части бяха съединени от край до край в правилния ред с помощта на ензима ДНК лигаза. Така, за разлика от репликацията на ДНК молекули, според А. Корнберг ** (виж Глава 24), Коранът успява да пресъздаде естествена двуверижна ДНК молекула според предварително планирана програма в съответствие с тРНК последователността, описана от Холи. По същия начин сега се работи върху синтеза на други гени (M. N. Kolosov, Z. A. Shabarova, D. G. Knorre, 1970 - 1975).

* (За изследването на генетичния код Г. Коран и М. Ниренберг са удостоени с Нобелова награда през 1968 г.)

** (За откриването на полимеразата и синтеза на ДНК А. Корнберг и за синтеза на РНК С. Очоа през 1959 г. е удостоен с Нобелова награда.)

Микрозоми, рибозоми, транслация

В средата на 50-те години се смяташе, че микрозомите са центърът на протеиновия синтез в клетката. Терминът микрозоми е въведен за първи път през 1949 г. от A. Claude за обозначаване на фракцията от малки гранули. По-късно се оказа, че не цялата фракция микрозоми, състояща се от мембрани и гранули, а само малки рибонуклеопротеинови частици, отговарят за синтеза на протеини. Тези частици през 1958 г. са наречени рибозоми от Р. Робъртс.

Класическите изследвания на бактериалните рибозоми са извършени от A. Tisier и J. Watson през 1958-1959 г. Бактериалните рибозоми се оказаха малко по-малки от растителните и животинските. J. Littleton (1960), M. Clark (1964) и E. N. Svetailo (1966) показват, че рибозомите на хлоропластите на висшите растения и митохондриите принадлежат към бактериалния тип. A. Tisier и други (1958) установяват, че рибозомите се разделят на две неравни субединици, съдържащи по една молекула РНК. В края на 50-те години се смяташе, че всяка рибозомна РНК молекула се състои от няколко къси фрагмента. Въпреки това, AS Spirin през 1960 г. е първият, който показва, че РНК в субчастиците е представена от непрекъсната молекула. D. Waller (1960), след като раздели рибозомните протеини с помощта на електрофореза с нишестен гел, установи, че те са много хетерогенни. Първоначално мнозина се съмняваха в данните на Уолър, тъй като изглеждаше, че рибозомният протеин трябва да бъде строго хомогенен, като например протеина TMV. Понастоящем, в резултат на изследванията на Д. Уолър, Р. Траут, П. Трауб и други биохимици, стана известно, че съставът на действителните рибозомни частици включва повече от 50 протеина, които са напълно различни по структура. AS Spirin през 1963 г. е първият, който разгръща рибозомни субчастици и показва, че рибозомите са компактно усукана рибонуклеопротеидна верига, която може да се разгъне при определени условия. През 1967 - 1968г М. Номура напълно реконструира биологично активна субединица от рибозомна РНК и протеин и дори получава рибозоми, в които протеинът и РНК принадлежат на различни микроорганизми.

Ролята на рибозомната РНК все още е неясна. Предполага се, че това е онази уникална специфична матрица, върху която при образуването на рибозомна частица всеки от многобройните рибозомни протеини намира строго определено място (А. С. Спирин, 1968).

A. Rich (1962) открива агрегати от няколко рибозоми, свързани помежду си с верига иРНК. Тези комплекси се наричат ​​полизоми. Откриването на полизоми позволи на Рич и Уотсън (1963) да предположат, че синтезът на полипептидната верига се извършва върху рибозомата, която сякаш се движи по веригата на иРНК. Докато рибозомата се движи по веригата на иРНК, информацията се прочита в частицата и се образува протеиновата полипептидна верига, а нови рибозоми се прикрепят алтернативно към освободения край за четене на иРНК. От данните на Рич и Уотсън следва, че значението на полизомите в клетката е в масовото производство на протеин чрез последователно четене на матрицата от няколко рибозоми наведнъж.

В резултат на изследванията на М. Ниренберг, С. Очоа, Ф. Липман, Г. Корана и др., през 1963 – 1970г. стана известно, че наред с иРНК, рибозоми, АТФ и аминоацил-тРНК, голям брой различни фактори участват в процеса на транслация, а самият процес на транслация може условно да бъде разделен на три етапа - инициация, сама транслация и прекратяване.

Инициацията на превода означава синтез на първия пептидна връзкав комплекса рибозома – матричен полинуклеотид – аминоацил-тРНК. Такава инициираща активност се притежава не от аминоацил-тРНК, а от формилметионил-тРНК. Това вещество е изолирано за първи път през 1964 г. от F. Senger и K. Marker. S. Bretcher и K. Marker (1966) показаха, че инициаторната функция на формилметионил-тРНК се дължи на нейния повишен афинитет към пептидилния център на рибозомата. За началото на транслацията са изключително важни и някои протеинови иницииращи фактори, които са изолирани в лабораториите на S. Ochoa, F. Gro и други изследователски центрове. След образуването на първата пептидна връзка в рибозомата започва самата транслация, т.е. последователно добавяне на аминоацилов остатък към С-края на полипептида. Много подробности от процеса на превод са изследвани от К. Монро и Дж. Бишоп (Англия), И. Рихлик и Ф. Шорм (Чехословакия), Ф. Липман, М. Бретчър, У. Гилбърт (САЩ) и други изследователи. През 1968 г. А. С. Спирин предлага оригинална хипотеза за обяснение на механизма на рибозомата. Задвижващият механизъм, който осигурява всички пространствени движения на tRNA и mRNA по време на транслация, е периодичното отваряне и затваряне на рибозомните субчастици. Терминирането на транслацията е кодирано в самата четима матрица, която съдържа терминиращите кодони. Както е показано от S. Brenner (1965 - 1967), триплетите UAA, UAG и UGA са такива кодони. M. Capecci (1967) също идентифицира специални протеинови терминиращи фактори. А. С. Спирин и Л. П. Гаврилова описват така наречения "неензимен" синтез на протеини в рибозомите (1972 - 1975 г.) без участието на протеинови фактори. Това откритие е важно за разбирането на произхода и еволюцията на протеиновата биосинтеза.

Регулиране на генната и протеиновата активност

След проблема за спецификата на протеиновия синтез, на първо място в молекулярната биология се оказа проблемът за регулацията на протеиновия синтез или, което е същото, регулацията на генната активност.

Функционалната нееквивалентност на клетките и потискането и активирането на гените, свързани с нея, отдавна привличат вниманието на генетиците, но доскоро истинският механизъм за контролиране на генната активност остава неизвестен.

Първите опити за обяснение на регулаторната активност на гените са свързани с изследването на хистонови протеини. Дори съпрузите Стедман * в началото на 40-те години на XX век. предполагат, че хистоните могат да играят основна роля в това явление. Впоследствие те получават първите ясни данни за разликите в химическата природа на хистоновите протеини. В момента броят на фактите, свидетелстващи в полза на тази хипотеза, нараства всяка година.

* (Е. Стедман, Е. Стедман. Основните протеини на клетъчните ядра.- Философ. прев. Рой. соц. Лондон, 1951 г., v. 235, 565 - 595.)

В същото време всичко се натрупва Повече ▼данни, които предполагат, че регулирането на генната активност е много по-сложен процес от простото взаимодействие на генни секции с хистонови протеинови молекули. През 1960 - 1962г в лабораторията на R. B. Khesin-Lurie беше установено, че фаговите гени започват да се четат едновременно: гените на T2 фага могат да бъдат разделени на ранни гени, функционирането на които се е случило в първите минути на инфекцията бактериална клетка, и по-късни, които започнаха да синтезират иРНК след завършване на работата на ранните гени.

През 1961 г. френските биохимици Ф. Жакоб и Ж. Моно предлагат схема за регулиране на генната активност, която изиграва изключителна роля за разбирането на регулаторните механизми на клетката като цяло. Според схемата на Якоб и Моно, освен структурни (информационни) гени, ДНК съдържа и гени-регулатори и гени-оператори. Регулаторният ген кодира синтеза на специфично вещество - репресор, който може да се прикрепи както към индукторния, така и към операторния ген. Операторният ген е свързан със структурни гени, докато регулаторният ген е разположен на известно разстояние от тях. Ако в околната среда няма индуктор, например лактоза, тогава репресорът, синтезиран от регулаторния ген, се свързва с операторния ген и, блокирайки го, изключва работата на целия оперон (блок от структурни гени заедно с оператора който ги контролира). При тези условия не се образува ензим. Ако в средата се появи индуктор (лактоза), тогава продуктът на регулаторния ген, репресорът, се свързва с лактозата и премахва блока от операторния ген. В този случай става възможна работата на структурния ген, кодиращ синтеза на ензима, и ензимът (лактоза) се появява в средата.

Според Джейкъб и Моно тази схема на регулиране е приложима за всички адаптивни ензими и може да се осъществи както по време на репресия, когато образуването на ензима се потиска от излишък на реакционния продукт, така и по време на индукция, когато въвеждането на субстрат причинява синтеза на ензима. За изследвания върху регулирането на генната активност Джейкъб и Моно получават Нобелова награда през 1965 г.

Първоначално тази схема изглеждаше твърде пресилена. По-късно обаче се оказа, че регулацията на гените според този принцип се извършва не само в бактериите, но и в други организми.

От 1960 г. видно място в молекулярната биология заемат изследванията на организацията на генома и структурата на хроматина в еукариотните организми (J. Bonner, R. Britten, W. Olfrey, P. Walker, Yu. S. Chentsov , I. B. Zbarsky и др.) и регулиране на транскрипцията (A. Mirsky, G. P. Georgiev, M. Bernstiel, D. Goll, R. Tsanev, R. I. Salganik). Дълго време природата на репресора остава неизвестна и противоречива. През 1968 г. M. Ptashne (САЩ) показа, че протеинът е репресор. Той го изолира в лабораторията на J. Watson и установява, че репресорът наистина има афинитет към индуктора (лактозата) и в същото време "разпознава" операторния ген на lac оперона и специфично се свързва с него.

През последните 5 - 7 години са получени данни за наличието на друга контролна клетка на генната активност - промоторната. Оказа се, че до мястото на оператора, към което е прикрепен продуктът, синтезиран върху регулаторния ген - протеиново веществорепресор, има още едно място, което също трябва да се припише на членовете на регулаторната система на генната активност. Приложен към този раздел протеинова молекулаЕнзим РНК полимераза. В промоторната област трябва да се осъществи взаимно разпознаване на уникалната нуклеотидна последователност в ДНК и специфичната конфигурация на РНК полимеразния протеин. Изпълнението на процеса на четене на генетична информация с дадена последователност от гени на оперона, съседен на промотора, ще зависи от ефективността на разпознаване.

В допълнение към схемата, описана от Jacob и Monod, има и други механизми на генна регулация в клетката. F. Jacob и S. Brenner (1963) установяват, че регулацията на репликацията на бактериалната ДНК се контролира по определен начин от клетъчната мембрана. Експериментите на Джейкъб (1954) за индуцирането на различни профаги убедително показаха, че под въздействието на различни мутагенни фактори в клетката на лизогенните бактерии започва селективна репликация на профагния ген и репликацията на генома на гостоприемника се блокира. През 1970 г. Ф. Бел съобщава, че малки ДНК молекули могат да преминат от ядрото в цитоплазмата и да се транскрибират там.

По този начин генната активност може да се регулира на ниво репликация, транскрипция и транслация.

Значителен напредък е постигнат в изучаването на регулацията не само на синтеза на ензими, но и на тяхната активност. A. Novik и L. Szilard посочиха феномена на регулиране на активността на ензимите в клетката още през 50-те години на миналия век. G. Umbarger (1956) установи, че в клетката има много рационален начин за потискане на активността на ензима краен продуктвериги за обратна връзка. Както е установено от J. Monod, J. Change, F. Jacob, A. Purdy и други изследователи (1956 - 1960), регулирането на ензимната активност може да се извърши според алостеричния принцип. Ензимът или една от неговите субединици, в допълнение към афинитета към субстрата, има афинитет към един от продуктите на реакционната верига. Под въздействието на такъв сигнален продукт ензимът променя своята конформация по такъв начин, че губи активност. В резултат на това цялата верига от ензимни реакции се изключва в самото начало. D. Wieman и R. Woodward (1952; Нобелов лауреат, 1965) изтъкват съществената роля на конформационните промени на протеините в ензимните реакции и в известен смисъл наличието на алостеричен ефект.

Структура и функция на протеините

В резултат на работата на Т. Осбърн, Г. Хофмайстер, А. Гурбер, Ф. Шулц и много други в края на XIX V. Много животински и растителни протеини са получени в кристална форма. Приблизително по същото време с помощта на различни физични методи са установени молекулните тегла на някои протеини. Така през 1891 г. А. Сабанеев и Н. Александров съобщават, че молекулното тегло на овалбумина е 14 000; през 1905 г. E. Reid установи, че молекулното тегло на хемоглобина е 48 000. Полимерната структура на протеините е открита през 1871 г. от G. Glasivetz и D. Gaberman. Идеята за пептидна връзка на отделни аминокиселинни остатъци в протеините е представена от Т. Курциус (1883). Работа върху химическата кондензация на аминокиселини (E. Schaal, 1871; G. Schiff, 1897; L. Balbiano и D. Traschiatti, 1900) и синтеза на хетерополипептиди (E. Fisher, 1902 - 1907, Нобелова награда, 1902) доведе до разработването на основните принципи химическа структурапротеини.

Първият кристален ензим (уреаза) е получен през 1926 г. от J. Sumner (Нобелова награда, 1946 г.), а през 1930 г. J. Northrop (Нобелова награда, 1946 г.) получава кристален пепсин. След тези работи стана ясно, че ензимите имат протеинова природа. През 1940 г. М. Куниц изолира кристална РНКаза. До 1958 г. вече са известни повече от 100 кристални ензима и над 500 некристални ензима. Получаването на високо пречистени препарати от отделни протеини допринесе за дешифрирането на тяхната първична структура и макромолекулна организация.

От голямо значение за развитието на молекулярната биология като цяло и по-специално на човешката генетика е откритието на L. Pauling (1940) за анормален хемоглобин S, изолиран от еритроцитите на хора с тежко наследствено заболяване, сърповидно-клетъчна анемия. През 1955 - 1957г W. Ingram използва метода на "пръстовия отпечатък", разработен от F. Sanger (петна, образувани от отделни пептиди по време на хроматография върху хартия), за да анализира продуктите от хидролизата на хемоглобин S с алкали и трипсин. През 1961 г. Ingram съобщава, че хемоглобин S се различава от нормалния хемоглобин само по естеството на един аминокиселинен остатък: в нормалния хемоглобин остатъкът от глутаминова киселина е на седма позиция на веригата, а в хемоглобин S - остатък от валин. Така предположението на Полинг (1949 г.), че сърповидно-клетъчната анемия е заболяване с молекулен характер, беше напълно потвърдено. Наследствена промяна само в един аминокиселинен остатък във всяка половина на макромолекулата на хемоглобина води до факта, че хемоглобинът губи способността си да се разтваря лесно при ниска концентрация на кислород и започва да кристализира, което води до нарушаване на клетъчната структура. Тези изследвания ясно показват, че структурата на протеина е строго определена аминокиселинна последователност, която е кодирана в генома. Работите на K. Anfinsen (1951) свидетелстват за изключителното значение на първичната структура на протеина при формирането на уникална биологично активна конформация на макромолекула. Anfinsen показа, че биологично активната макроструктура на панкреатичната рибонуклеаза, която се губи в резултат на възстановяване, е предварително определена от аминокиселинната последователност и може да се появи отново спонтанно по време на окисляването на SH групи от цистеинови остатъци с образуването на дисулфидни омрежвания в стриктно определени места от пептидната верига на ензима.

Към днешна дата механизмът на действие е проучен подробно. Голям бройензими и е определена структурата на много протеини.

През 1953 г. F. Sanger установява аминокиселинната последователност на инсулина. : Този протеин се състои от две полипептидни вериги, свързани с две дисулфидни напречни връзки. Една от веригите съдържа само 21 аминокиселинни остатъка, докато другата съдържа 30 остатъка. Sanger прекарва около 10 години в дешифриране на структурата на този сравнително прост протеин. През 1958 г. той получава Нобелова награда за това изключително изследване. След създаването на V. Stein и S. Moore (1957) на автоматичен анализатор на аминокиселини, идентифицирането на продукти от частична хидролиза на протеини се ускори значително. През 1960 г. Стайн и Мур вече съобщават за това. че са успели да определят последователността на рибонуклеазата, чиято пептидна верига е представена от 124 аминокиселинни остатъка. През същата година в лабораторията на G. Schramm в Тюбинген (Германия) F. Anderer и други определят аминокиселинната последователност в протеина TMV. След това се определя аминокиселинната последователност в миоглобин (A. Edmunson) и α- и β-вериги на човешки хемоглобин (G. Braunitzer, E. Schroeder и др.), Лизоцим от яйчен протеин (J. Jollet, D. Keyfield) . През 1963 г. Ф. Шорм и Б. Кейл (Чехословакия) установяват последователността на аминокиселините в молекулата на химотрипсиногена. През същата година е определена аминокиселинната последователност на трипсиногена (F. Shorm, D. Walsh). През 1965 г. К. Такахаши установява първичната структура на рибонуклеазата Т1. След това аминокиселинната последователност беше определена за още няколко протеина.

Както е известно, окончателното доказателство за правилността на дефиницията на определена структура е нейният синтез. През 1969 г. R. Merifield (САЩ) е първият, който извършва химичен синтез на панкреатична рибонуклеаза. Използвайки метода на синтез, който разработи върху твърдофазов носител, Мерифийлд добавя една аминокиселина след друга към веригата в съответствие с последователността, описана от Stein и Moore. В резултат на това той получава протеин, който е идентичен по качество с панкреатична рибонуклеаза А. За откриването на структурата на рибонуклеазата V. Stein, S. Moore и K. Anfinsen получават Нобелова награда през 1972 г. Този естествен протеинов синтез отваря огромни перспективи, сочейки възможността за създаване на всякакви протеини в съответствие с предварително планирана последователност.

От рентгенови изследвания на W. Astbury (1933) следва, че пептидните вериги на протеиновите молекули са усукани или подредени по някакъв строго определен начин. Оттогава много автори са изразили различни хипотези за начините, по които протеиновите вериги се сгъват, но до 1951 г. всички модели остават спекулативни конструкции, които не съответстват на експерименталните данни. През 1951 г. Л. Полинг и Р. Кори публикуват поредица от блестящи произведения, в които окончателно е формулирана теорията за вторичната структура на протеините, теорията на α-спиралата. Заедно с това стана известно също, че протеините имат и третична структура: α-спиралата на пептидната верига може да бъде сгъната по определен начин, образувайки доста компактна структура.

През 1957 г. J. Kendrew и неговите сътрудници за първи път предлагат триизмерен модел на структурата на миоглобина. След това този модел беше усъвършенстван в продължение на няколко години, докато не се появи през 1961 г финална работас характеристика на пространствената структура на този протеин. През 1959 г. М. Перуц и колеги установяват триизмерната структура на хемоглобина. Изследователите са прекарали повече от 20 години в тази работа (първите рентгенови снимки на хемоглобина са получени от Perutz през 1937 г.). Тъй като молекулата на хемоглобина се състои от четири субединици, след като е дешифрирал нейната организация, Перуц първо описва кватернерната структура на протеина. За работата си по определянето на триизмерната структура на протеините, Кендрю и Перуц са удостоени с Нобелова награда през 1962 г.

Създаването на пространствен модел на структурата на хемоглобина от Perutz ДОПУСКА. да се доближим до разбирането на механизма на функциониране на този протеин, който, както е известно, осъществява транспорта на кислород в животинските клетки. Още през 1937 г. Ф. Гауровиц стига до извода, че взаимодействието на хемоглобина с кислород, въздух трябва да бъде придружено от промяна в структурата на протеина. През 60-те години на миналия век Perutz и сътрудници откриват забележимо изместване във веригите на хемоглобина след неговото окисляване, причинено от изместването на железни атоми в резултат на свързване с кислорода. На тази основа се формират идеи за "дишането" на протеиновите макромолекули.

През 1960 г. Д. Филипс и неговите сътрудници започват изследвания с рентгенова дифракция на молекулата на лизозима. До 1967 г. те повече или по-малко успяват да установят подробностите за организацията на този протеин и локализацията на отделните атоми в неговата молекула. В допълнение, Филипс установи естеството на добавянето на лизозим към субстрата (триацетилглюкозамин). Това направи възможно пресъздаването на механизма на този ензим. По този начин познаването на първичната структура и макромолекулната организация позволи не само да се установи природата на активните центрове на много ензими, но и да се разкрие напълно механизмът на функциониране на тези макромолекули.

Използването на методи на електронна микроскопия помогна да се разкрият принципите на макромолекулната организация на такива сложни протеинови образувания като колаген, фибриноген, контрактилни мускулни фибрили и др. В края на 50-те години бяха предложени модели на мускулния контрактилен апарат. От изключителна важност за разбирането на механизма на мускулна контракция е откритието на В. А. Енгелгард и М. Н. Любимова (1939) на АТФазната активност на миозина. Това означава, че актът на мускулна контракция се основава на промяна във физикохимичните свойства и макромолекулната организация на контрактилния протеин под въздействието на аденозинтрифосфорна киселина (виж също Глава 11).

Вирусологичните изследвания бяха от съществено значение за разбирането на принципите на сглобяване на биологични структури (виж Глава 25).

Неразрешени въпроси

Основният напредък в съвременната молекулярна биология е постигнат главно в резултат на изследването на нуклеиновите киселини. Но дори и в тази област далеч не всички проблеми са решени. Ще бъдат необходими големи усилия, по-специално, за да се дешифрира цялата нуклеотидна последователност на генома. Този проблем от своя страна е неразривно свързан с проблема за хетерогенността на ДНК и изисква разработването на нови усъвършенствани методи за фракциониране и изолиране на отделни молекули от общия генетичен материал на клетката.

Досега усилията бяха насочени главно към отделното изследване на протеини и нуклеинови киселини. В клетката тези биополимери са неразривно свързани помежду си и функционират главно под формата на нуклеопротеини. Следователно необходимостта от изследване на взаимодействието на протеини и нуклеинови киселини сега стана особено остра. Проблемът с разпознаването от протеини на определени участъци от нуклеинови киселини излиза на преден план. Вече са очертани стъпки към изучаване на такова взаимодействие на тези биополимери, без което пълното разбиране на структурата и функциите на хромозомите, рибозомите и други структури е немислимо. Без това също е невъзможно да се разбере регулацията на генната активност и накрая да се дешифрират принципите на работата на механизмите за синтез на протеини. След работата на Jacob и Monod се появиха някои нови данни за регулаторното значение на мембраните в синтеза на ядрен материал. Това поставя проблема за по-задълбочено изследване на ролята на мембраните в регулирането на репликацията на ДНК. Като цяло, проблемът за регулиране на генната активност и клетъчната активност като цяло се превърна в един от най-важните проблеми на съвременната молекулярна биология.

Съвременното състояние на биофизиката

В тясна връзка с проблемите на молекулярната биология протича развитието на биофизиката. Интересът към тази област на биологията беше стимулиран, от една страна, от необходимостта от цялостно изследване на ефекта на различните видове радиация върху тялото, а от друга страна, от необходимостта да се изучават физическите и физико-химични основи на жизнените явления, протичащи на молекулярно ниво.

Получаването на точна информация за молекулярните структури и процесите, протичащи в тях, стана възможно в резултат на използването на нови фини физични и химични методи. Въз основа на постиженията на електрохимията беше възможно да се подобри методът за измерване на биоелектричните потенциали чрез използване на йон-селективни електроди (G. Eisenman, B.P. Nikolsky, Khuri, 50-60-те години). Все по-широко навлиза в практиката инфрачервената спектроскопия (с използването на лазерни устройства), която позволява да се изследват конформационните промени в протеините (И. Плотников, 1940 г.). Ценна информация предоставя и методът на електронен парамагнитен резонанс (E. K. Zavoisky, 1944) и биохемилуминесцентният метод (B. N. Tarusov et al., 1960), които позволяват по-специално да се прецени транспортирането на електрони по време на окислителни процеси.

До 50-те години на миналия век биофизиката вече печели силни позиции. Има нужда от подготовка на квалифицирани специалисти. Ако през 1911 г. в Европа само университетът в Печ, Унгария, е имал катедра по биофизика, то към 1973 г. такива катедри съществуват в почти всички големи университети.

През 1960 г. е организирано Международното дружество на биофизиците. През август 1961 г. в Стокхолм се провежда първият Международен биофизичен конгрес. Вторият конгрес се провежда през 1965 г. в Париж, третият - през 1969 г. в Бостън, четвъртият - през 1972 г. в Москва.

В биофизиката има ясно разграничение между две области с различно съдържание - молекулярна биофизика и клетъчна биофизика. Това разграничение получава и организационен израз: създават се отделни катедри от тези две области на биофизиката. В Московския университет първата катедра по биофизика е създадена през 1953 г. във Факултета по биология и почвознание, а малко по-късно катедрата по биофизика се появява във Физическия факултет. Катедрите бяха организирани на същия принцип в много други университети.

Молекулярна биофизика

През последните години връзката между молекулярната биофизика и молекулярната биология все повече се засилва и сега понякога е трудно да се определи къде е разделителната линия между тях. При обща атака срещу проблема с наследствената информация подобно сътрудничество между биофизиката и молекулярната биология е неизбежно.

Основното направление в изследователска работае изучаването на физиката на нуклеиновите киселини - ДНК и РНК. Използването на горните методи и преди всичко на рентгеновия дифракционен анализ допринесе за дешифрирането на молекулярната структура на нуклеиновите киселини. В момента се провеждат интензивни изследвания за изследване на поведението на тези киселини в разтвори. Особено внимание е отделено на конформационните преходи "спирала-намотка", които се изследват чрез промени във вискозитета, оптичните и електрическите параметри. Във връзка с изучаването на механизмите на мутагенезата се разработват изследвания за изследване на ефекта на йонизиращото лъчение върху поведението на нуклеиновите киселини в разтвори, както и ефекта на радиацията върху нуклеиновите киселини на вируси и фаги. Ефектът от ултравиолетовото лъчение, за някои спектрални области от което е известно, че се абсорбират добре от нуклеиновите киселини, беше подложен на цялостен анализ. Голям специфично теглов този вид изследване е откриването на активни радикали на нуклеинови киселини и протеини чрез метода на електронен парамагнитен резонанс. С използването на този метод се свързва появата на цяла независима посока.

Проблемът с кодирането на ДНК и РНК информацията и нейното предаване по време на протеиновия синтез отдавна е от интерес за молекулярната биофизика и физиците многократно са изразявали определени съображения по този въпрос (Е. Шрьодингер, Г. Гамов). Дешифрирането на генетичния код предизвика множество теоретични и експериментални изследвания върху структурата на спиралата на ДНК, механизма на плъзгане и усукване на нейните нишки, върху изследването физическа силаучастващи в тези процеси.

Молекулярната биофизика оказва значителна помощ на молекулярната биология при изучаването на структурата на протеиновите молекули с помощта на рентгенов дифракционен анализ, използван за първи път през 1930 г. от J. Bernal. Именно в резултат на използването на физични методи в комбинация с биохимични (ензимни методи) бяха разкрити молекулярната конформация и последователността на аминокиселините в редица протеини.

Съвременните електронномикроскопски изследвания, които разкриват наличието на сложни мембранни системи в клетките и техните органели, стимулират опитите за разбиране на тяхната молекулна структура (вижте глави 10 и 11). Изследван in vivo химичен съставмембрани и по-специално свойствата на техните липиди. Установено е, че последните са способни на свръхокисляване и неензимни реакции на верижно окисление (Ю. А. Владимиров и Ф. Ф. Литвин, 1959; Б. Н. Тарусов и др., 1960; И. И. Иванов, 1967), което води до дисфункция на мембраната. За изследване на състава на мембраните започнаха да се използват и методи на математическо моделиране (В. Ц. Пресман, 1964 - 1968; М. М. Шемякин, 1967; Ю. А. Овчинников, 1972).

Клетъчна биофизика

Значително събитие в историята на биофизиката е формирането през 50-те години на ясни идеи за термодинамиката биологични процеси, в резултат на което окончателно изчезнаха предположенията за възможността за независимо генериране на енергия в живите клетки, противно на втория закон на термодинамиката. Разбирането на действието на този закон в биологичните системи е свързано с въвеждането от белгийския учен И. Пригожин (1945) * в биологичната термодинамика на понятието отворени системикоито обменят енергия и материя с околната среда. Пригожин показа, че положителна ентропия се образува в живите клетки по време на работни процеси в съответствие с втория закон на термодинамиката. Уравненията, които въведе, определят условията, при които възниква така нареченото стационарно състояние (преди това се наричаше още динамично равновесие), при което количеството безплатна енергия(негентропия), която навлиза в клетките с храната, компенсира потреблението й, а положителната ентропия се отделя. Това откритие затвърди общата биологична идея за неразривната връзка между външната и вътрешната среда на клетките. Той бележи началото на истинско изследване на термодинамиката на живите системи, включително метода на моделиране (A. Burton, 1939; A. G. Pasynsky, 1967).

* (обща теорияотворените системи е представена за първи път от Л. Берталанфи през 1932 г.)

Според основния принцип на биотермодинамиката, необходимо условиеСъществуването на живота се оказва стационарност в развитието на неговите биохимични процеси, за осъществяването на които е необходима координация на скоростите на множество метаболитни реакции. Въз основа на новата биофизична термодинамика се появи тенденция, която отделя външни и вътрешни фактори, които осигуряват тази координация на реакциите и я правят стабилна. През последните две десетилетия е разкрита голяма роля в поддържането на стационарно състояние на системата от инхибитори и особено антиоксиданти (Б. Н. Тарусов и А. И. Журавлев, 1954, 1958). Установено е, че надеждността на стационарното развитие е свързана с факторите на околната среда (температура) и физикохимичните свойства на клетъчната среда.

Съвременните принципи на биотермодинамиката позволиха да се даде физикохимична интерпретация на механизма на адаптация. Според нашите данни, адаптирането към условията на околната среда може да възникне само ако, когато те се променят, организмът е в състояние да установи стационарност в развитието на био химична реакция(Б. Н. Тарусов, 1974). Възникна въпросът за разработването на нови методи, които биха позволили оценка на стационарното състояние in vivo и прогнозиране на възможните му нарушения. Въвеждането на кибернетичните принципи на саморегулиращите се системи в биотермодинамиката и изследването на процесите на биологична адаптация обещава голяма полза. Стана ясно, че за да се реши проблемът със стабилността на стационарното състояние, е важно да се вземат предвид така наречените смущаващи фактори, които включват по-специално неензимни реакции на окисление на липидите. IN напоследъкВсе повече се разширяват изследванията върху процесите на свръхокисление в липидните фази на живите клетки и растежа на активни радикални продукти, които нарушават регулаторните функции на мембраните. Източникът на информация за тези процеси е както откриването на активни пероксидни радикали, така и пероксидни съединения на биолипидите (A. Tappel, 1965; I. I. Ivanov, 1965; E. B. Burlakova, 1967 и др.). За откриване на радикали се използва биохемилуминесценция, която възниква в липидите на живите клетки по време на тяхната рекомбинация.

Въз основа на физикохимичните идеи за стабилността на стационарното състояние възникват биофизични идеи за адаптирането на растенията към промените в условията на околната среда като нарушение на инхибиторните антиоксидантни системи (Б. Н. Тарусов, Я. Е. Доскоч, Б. М. Китлаев, А. М. Агавердиев, 1968 - 1972). Това отвори възможността за оценка на такива свойства като устойчивост на замръзване и устойчивост на сол, както и да се направят подходящи прогнози при избора на селскостопански растения.

През 50-те години на миналия век е открито свръхслабо сияние - биохемилуминесценция на редица биологични обекти във видимата и инфрачервената част на спектъра (Б. Н. Тарусов, А. И. Журавлев, А. И. Поливода). Това стана възможно в резултат на разработването на методи за регистриране на свръхслаби светлинни потоци с помощта на фотоумножители (Л. А. Кубецки, 1934 г.). Като резултат от биохимични реакции, протичащи в жива клетка, биохемилуминесценцията дава възможност да се преценят важни окислителни процеси във веригите за пренос на електрони между ензимите. Откриването и изследването на биохемилуминесценцията е от голямо теоретично и практическо значение. Така Б. Н. Тарусов и Ю. йонизиращо лъчение, с канцерогенеза и други нарушения нормални функцииклетки.

През 50-те години на миналия век, във връзка с бързото развитие на ядрената физика, радиобиологията се отделя от биофизиката. биологично действиейонизиращо лъчение. Получаване на изкуствени радиоактивни изотопи, създаване на термоядрени оръжия, ядрени реактории развитието на други форми на практическо използване на атомната енергия постави с цялата си острота проблема за защита на организмите от вреден ефектйонизиращо лъчение, развитие теоретични основипрофилактика и лечение на лъчева болест. За да направите това, беше необходимо преди всичко да разберете кои компоненти на клетката и връзките на метаболизма са най-уязвими.

Обектът на изследване на биофизиката и радиобиологията беше изясняването на природата на първичните химични реакции, протичащи в живите субстрати под въздействието на радиационна енергия. Тук беше важно не само да се разберат механизмите на това явление, но и да се повлияе на процеса на обмен на физическа енергия за химическа енергия, за да се намали коефициентът му на "полезно" действие. Работата в тази посока е инициирана от изследванията на школата на Н. Н. Семенов (1933) в СССР и Д. Хиншелуд (1935) в Англия.

Важно място в радиобиологичните изследвания заема изучаването на степента на радиационна устойчивост на различни организми. Установено е, че повишената радиорезистентност (например при пустинни гризачи) се дължи на високата антиоксидантна активност на липидите на клетъчната мембрана (M. Chang et al., 1964; N. K. Ogryzov et al., 1969). Оказа се, че токоферолите, витамин К и тио съединенията играят важна роля във формирането на антиоксидантните свойства на тези системи (И. И. Иванов и др., 1972). През последните години изследванията на механизмите на мутагенезата също привлякоха голямо внимание. За тази цел се изследва влиянието на йонизиращото лъчение върху поведението на нуклеиновите киселини и протеините in vitro, както и във вирусите и фагите (A. Gustafson, 1945 - 1950).

Борбата за по-нататъшно повишаване на ефективността на химическата защита, търсенето на по-ефективни инхибитори и принципи на инхибиране остават основните задачи на биофизиката в тази посока.

Постигнат е напредък в изследването на възбудените състояния на биополимерите, които определят тяхната висока химична активност. Най-успешно беше изследването на възбудени състояния, възникващи в първичния етап на фотобиологичните процеси - фотосинтеза и зрение.

По този начин е направен солиден принос за разбирането на първичното активиране на молекулите на растителните пигментни системи. Установено е голямото значение на преноса (миграцията) на енергията на възбудени състояния без загуба от активирани пигменти към други субстрати. Голяма роля в развитието на тези идеи изиграха теоретичните трудове на А. Н. Теренин (1947 г. и по-късно). A. A. Krasnovsky (1949) открива и изследва реакцията на обратима фотохимична редукция на хлорофила и неговите аналози. Сега има общо убеждение, че в близко бъдеще ще бъде възможно да се възпроизведе фотосинтезата при изкуствени условия (виж също Глава 5).

Биофизиците продължават да работят върху разкриването на естеството на мускулната контракция и механизмите нервна възбудаи поведение (вижте глава 11). Изследванията на механизмите на прехода от възбудено състояние към нормално състояние също станаха актуални. Сега възбуденото състояние се разглежда като резултат от автокаталитична реакция, а инхибирането се разглежда като следствие от рязка мобилизация на инхибиторната антиоксидантна активност в резултат на молекулярни пренареждания в съединения като токоферол (I.I. Ivanov, O.R. Kols, 1966; O.R. Колс, 1970).

Най-важният общ проблем на биофизиката остава познаването на качествените физични и химични характеристики на живата материя. Свойства като способността на живите биополимери селективно да свързват калия или да поляризират електричество, не може да се запази дори при най-внимателно отстраняване от тялото. Следователно клетъчната биофизика продължава интензивно да разработва критерии и методи за изследване на живота на живата материя.

Въпреки младостта на молекулярната биология, напредъкът, който тя постигна в тази област, е наистина зашеметяващ. За сравнително кратък период от време е установена природата на гена и основните принципи на неговата организация, възпроизвеждане и функциониране. Освен това е извършено не само in vitro възпроизвеждане на гени, но и за първи път е завършен пълният синтез на самия ген. Напълно е дешифриран генетичният код и е решен най-важният биологичен проблем за спецификата на биосинтезата на протеини. Идентифицирани и проучени са основните пътища и механизми на образуване на протеини в клетката. Първичната структура на мн транспортна РНК- специфични адаптерни молекули, които превеждат езика на нуклеиновите матрици на езика на аминокиселинната последователност на синтезирания протеин. Аминокиселинната последователност на много протеини е напълно дешифрирана и е установена пространствената структура на някои от тях. Това позволи да се изяснят принципът и детайлите на функционирането на ензимните молекули. Извършен е химичен синтез на един от ензимите рибонуклеаза. Установени са основните принципи на организацията на различни субклетъчни частици, много вируси и фаги и са разкрити основните пътища на тяхната биогенеза в клетката. Открити са подходи за разбиране на начините за регулиране на генната активност и изясняване на регулаторните механизми на жизнената дейност. Вече прост списък на тези открития показва, че втората половина на 20 век. беше белязан от огромен напредък в биологията, който се дължи преди всичко на задълбочено изследване на структурата и функциите на биологично важни макромолекули - нуклеинови киселини и протеини.

Постиженията на молекулярната биология вече се използват в практиката днес и дават осезаеми резултати в медицината, селското стопанство и някои индустрии. Няма съмнение, че завръщането на тази наука ще нараства всеки ден. Основният резултат обаче все пак трябва да се счита, че под влиянието на успехите на молекулярната биология се засили увереността в съществуването на неограничени възможности по пътя към разкриването на най-тайните тайни на живота.

В бъдеще, очевидно, ще бъдат открити нови начини за изучаване на биологичната форма на движението на материята - биологията ще премине от молекулярно ниво към атомно ниво. Сега обаче може би няма нито един изследовател, който да може реалистично да предвиди развитието на молекулярната биология дори за следващите 20 години.

интервю

Пирогов Сергей - участник в подготовката за олимпиадата по биология, организирана от "Слон и жираф" през 2012 г.
Победител в Международната универсиада по биология
Победителят в олимпиадата "Ломоносов"
Победител в регионален етап Всеруска олимпиадапо биология през 2012 г
Учи в Московския държавен университет. М.В. Ломоносов в Биологическия факултет: Катедра по молекулярна биология, студент 6-та година. Работи в лабораторията по биохимична генетика на животните на Института по молекулярна генетика.

- Серьожа, ако читателите имат въпроси, ще могат ли да ви зададат?

Да, разбира се, можете да задавате въпроси поне веднага. В това поле:

Щракнете тук, за да зададете въпрос.

- Да започнем с училището, нямахте ли супер готино училище?

Учих в много слабо московско училище, такова средно училище. Вярно, имахме прекрасен преподавател в Московския художествен театър, благодарение на когото имахме до голяма степен номинална "изкуствоведска" ориентация на училището.

- Ами биологията?

Нашата учителка по биология беше много възрастна, глуха и остра жена, от която всички се страхуваха. Но любовта към нейния предмет не добави. Запалих се по биологията от дете, от петгодишна възраст. Четох всичко сам, основно увлечен от анатомията и зоологията. Така училищни предметисъществуваше успоредно на собствените ми интереси. Олимпиадата промени всичко.

- Разкажи ми повече.

В 7-ми клас за първи път участвах в общинския етап (разбира се, почти по всички предмети наведнъж, тъй като бях единственият ученик, когото учителите имаха основание да изпратят). И спечели по биология. Тогава училището се отнасяше към това като към смешен, но не особено интересен факт.

- Помогна ли ти в училище?

Спомням си, че въпреки блестящото ми учене, често получавах B от учител по биология с придирчивост като „на чертежа на част от лук корените трябва да бъдат боядисани в кафяво, а не в сиво“. Всичко беше доста депресиращо. В 8 клас отново отидох на олимпиада, но по някаква причина не ме изпратиха по биология. Но той стана победител и победител в други предмети.

- Какво се случи в 9 клас?

В 9-ти клас не отидох на областен етап. Там неочаквано изкарах слаб, граничен резултат, който въпреки всичко се оказа, че преминава за областен етап. Това имаше мощна мотивираща сила - осъзнаването колко много не знам и колко хора знаят всичко това (колко такива хора в национален мащаб дори се страхувах да си представя).

- Разкажи ни как се подготви.

Интензивното самообучение, набезите в книжарниците и хилядите задачи от миналата година имаха оздравителен ефект. Постигнах един от най-високите резултати на теорията (което също беше напълно неочаквано за мен), отидох на практическия етап ... и го провалих. По това време дори не знаех за съществуването на практическата сцена.

- Олимпиадата повлия ли ви?

Животът ми се промени коренно. Научих за много други олимпиади, особено се влюбих в SBO. Впоследствие той показа мн добри резултати, някои спечелиха, благодарение на "Ломоносовская" получиха правото да влизат без изпити. Паралелно печелех олимпиади по история на изкуството, към които все още дишам неравномерно. Вярно, той не беше приятел с практически обиколки. В 11 клас все пак стигнах до финалния етап, но съдбата не беше благосклонна и този път нямах време да попълня матрицата с отговори на теоретичния етап. Но това направи възможно да не се тревожим твърде много за практическото.

- Срещали ли сте много олимпиади?

Да, все още смятам, че имах голям късмет с кръга от мои връстници, които значително разшириха хоризонтите ми. Другата страна на олимпиадите, в допълнение към мотивацията за по-хармонично изучаване на предмета, беше запознаването с олимпиадите. Още по това време забелязах, че хоризонталната комуникация понякога е по-полезна от вертикалната – с учителите в тренировъчния лагер.

- Как влязохте в университета? Избрахте ли факултет?

След 11 клас постъпих в Биологическия факултет на Московския държавен университет. Просто мнозинството от моите тогавашни другари направиха избор в полза на FBB, но тук основната роля изигра фактът, че не станах победител в All-Russian. Значи трябваше да се явя на вътрешен изпит по математика, а на него, особено училището - много повече се влюбих във висшето - не бях силна. И имаше много лоша подготовка в училище (дори не бяхме подготвени за почти цялата C част). От гледна точка на интересите, още тогава предположих, че в крайна сметка можете да стигнете до всякакъв резултат, независимо от мястото на прием. Впоследствие се оказа, че има много завършили ФББ, които са преминали към предимно мокра биология и обратното – много добри биоинформатици са започнали като аматьори. Въпреки че в този момент ми се струваше, че контингентът в биологичния факултет ще бъде различен от FBBshny. В това определено сгреших.

Знаеше ли?

интересно

Знаеше ли?

интересно

В лагера "Слон и жираф" има смени по биохимия и молекулярна биология, където учениците, заедно с опитни преподаватели от Московския държавен университет, поставят експерименти и също се подготвят за олимпиади.

© Интервюто взе Решетов Денис. Снимките са любезно предоставени от Сергей Пирогов.

Молекулярна биология,наука, която си поставя за задача познаването на природата на жизнените явления чрез изучаване на биологични обекти и системи на ниво, приближаващо се до молекулярното ниво, а в някои случаи достигащо тази граница. Крайната цел в случая е да се изясни как и до каква степен характерните прояви на живота, като наследственост, размножаване на себеподобните, биосинтеза на протеини, възбудимост, растеж и развитие, съхранение и предаване на информация, енергийни трансформации, мобилност, т.е. и др., се дължат на структурата, свойствата и взаимодействието на молекулите на биологично важни вещества, преди всичко на двата основни класа високомолекулни биополимери - протеини и нуклеинови киселини. Отличителна черта на M. b. - изследване на явленията на живота върху неодушевени обекти или такива, които се характеризират с най-примитивните прояви на живота. Това са биологични образуванияот клетъчно ниво и по-надолу: субклетъчни органели като изолирани клетъчни ядра, митохондрии, рибозоми, хромозоми, клетъчни мембрани; по-нататък - системи, стоящи на границата на живата и неживата природа - вируси, включително бактериофаги, и завършващи с молекулите на най-важните компоненти на живата материя - нуклеинови киселини и протеини.

Основата, върху която се развива М., е поставена от такива науки като генетика, биохимия, физиология на елементарните процеси и др. неразривно свързан с молекулярна генетика, което продължава да бъде важна част

Отличителна черта на M. b. е нейната триизмерност. Същността на M. b. М. Перуц го вижда в тълкуването на биологичните функции от гледна точка на молекулярната структура. М. б. има за цел да получи отговори на въпроса "как", познавайки същността на ролята и участието на цялата структура на молекулата, както и на въпросите "защо" и "защо", като установи, от една страна, връзката между свойствата на молекулата (отново преди всичко протеини и нуклеинови киселини) и изпълняваните от нея функции и, от друга страна, ролята на такива отделни функции в общия комплекс от прояви на жизнената дейност.

Ключови постижениямолекулярна биология.Ето далеч не пълен списък на тези постижения: разкриване на структурата и механизма на биологичната функция на ДНК, всички видове РНК и рибозоми, разкриване на генетичния код; откриване на обратна транскрипция, т.е. синтез на ДНК върху матрица на РНК; изследване на механизмите на функциониране на дихателните пигменти; откриване на триизмерната структура и нейната функционална роля в действието на ензимите, принципа на матричния синтез и механизмите на протеиновата биосинтеза; разкриване на структурата на вирусите и механизмите на тяхната репликация, първичната и отчасти пространствената структура на антителата; изолиране на отделни гени, химически и след това биологичен (ензимен) генен синтез, включително човешки, извън клетката (in vitro); трансфер на гени от един организъм в друг, включително в човешки клетки; бързо напредващото дешифриране на химическата структура на нарастващ брой отделни протеини, главно ензими, както и нуклеинови киселини; откриване на феномена на "самосглобяването" на някои биологични обекти с все по-голяма сложност, като се започне от молекулите на нуклеиновата киселина и се стигне до многокомпонентни ензими, вируси, рибозоми и др.; изясняване на алостеричните и други основни принципи на регулация на биологичните функции и процеси.

Проблеми на молекулярната биология.Наред с посочените важни задачи М. би. (познаване на законите на "разпознаването", самосглобяването и интегрирането) действителна посока на научното търсене в близкото бъдеще е разработването на методи, които позволяват дешифриране на структурата, а след това и триизмерната, пространствена организация на високомолекулни нуклеинова киселина. Всички най-важни методи, чието използване осигури появата и успеха на M. b., бяха предложени и разработени от физици (ултрацентрофугиране, рентгенов дифракционен анализ, електронна микроскопия, ядрено-магнитен резонанс и др.). Почти всички нови физични експериментални подходи (например използването на компютри, синхротронно или спирачно лъчение, радиация, лазерна технология и други) откриват нови възможности за задълбочено изследване на проблемите на M. b. Между критични задачиот практическо естество, отговорът на който се очаква от М. б., на първо място е проблемът за молекулярната основа на злокачествения растеж, след това - начините за предотвратяване, а може би и преодоляване наследствени заболявания- Молекулярни заболявания. От голямо значение ще бъде изясняването на молекулярната основа на биологичната катализа, т. е. действието на ензимите. Сред най-важните съвременни направления на M. b. трябва да включва желанието да се дешифрират молекулярните механизми на действие на хормони, токсични и лекарствени вещества, както и да се открият подробности за молекулярната структура и функционирането на такива клетъчни структури като биологични мембраниучастващи в регулирането на проникването и транспорта на веществата. По-далечни цели М. б. - познаване на природата на нервните процеси, механизмите на паметта и др. Един от важните нововъзникващи раздели на M. b. - т.нар. генно инженерство, което си поставя за задача целенасоченото функциониране на генетичния апарат (генома) на живите организми, като се започне от микроби и по-ниски (едноклетъчни) и се стигне до човека (в последния случай, предимно с цел радикално лечение на наследствени заболявания и корекция на генетични дефекти).

Най-важните направления на MB:

– Молекулярна генетика– изследване на структурната и функционална организация на генетичния апарат на клетката и механизма за внедряване на наследствената информация

– Молекулярна вирусология – изследване на молекулярните механизми на взаимодействие на вирусите с клетките

– Молекулярна имунология – изследване на моделите на имунните реакции на организма

– Молекулярна биология на развитието – изследване на появата на клетъчно разнообразие по време на индивидуално развитиеорганизми и клетъчни специализации

Основни обекти на изследване: Вируси (включително бактериофаги), Клетки и субклетъчни структури, Макромолекули, Многоклетъчни организми.