Mitä molekyylibiologia tutkii. Molekyylibiologin ammatti. Nukleiinihappojen geneettisen roolin määrittäminen

Nukleiinihappojen ja proteiinien biosynteesin tutkimuksen edistyminen on johtanut useiden menetelmien luomiseen, joilla on suuri käytännön merkitys lääketieteessä, maataloudessa ja useilla muilla teollisuudenaloilla.

Geneettisen koodin sekä perinnöllisen tiedon tallennuksen ja toteuttamisen perusperiaatteiden tutkimisen jälkeen molekyylibiologian kehitys pysähtyi, koska ei ollut menetelmiä, jotka olisivat mahdollistaneet geenien manipulointia, eristämistä ja muuttamista. Nämä menetelmät syntyivät 1970-1980-luvuilla. Tämä antoi voimakkaan sysäyksen tämän edelleen kukoistavan tieteenalan kehitykselle. Ensinnäkin nämä menetelmät koskevat yksittäisten geenien hankkimista ja niiden viemistä muiden organismien soluihin (molekyylikloonaus ja siirtogeneesi, PCR) sekä menetelmiä geenien nukleotidisekvenssin määrittämiseksi (DNA- ja RNA-sekvensointi). Näitä menetelmiä käsitellään yksityiskohtaisemmin alla. Aloitamme yksinkertaisimmalla perusmenetelmällä, elektroforeesilla, ja siirrymme sitten monimutkaisempiin menetelmiin.

DNA ELEKTROFOREESI

Se on DNA:n kanssa työskentelyn perusmenetelmä, jota käytetään lähes kaikkien muiden menetelmien ohella haluttujen molekyylien eristämiseen ja tulosten analysointiin. Geelielektroforeesia käytetään DNA-fragmenttien erottamiseen pituuden mukaan. DNA on happo, sen molekyylit sisältävät fosforihappojäämiä, jotka irrottavat protonin ja saavat negatiivisen varauksen (kuva 1).

Siksi sähkökentässä DNA-molekyylit liikkuvat kohti anodia - positiivisesti varautunutta elektrodia. Tämä tapahtuu varauksenkantaja-ioneja sisältävässä elektrolyyttiliuoksessa, minkä vuoksi tämä liuos johtaa virtaa. Fragmenttien erottamiseen käytetään tiheää polymeereistä (agaroosista tai polyakryyliamidista) valmistettua geeliä. DNA-molekyylit "kietoutuvat" siihen mitä enemmän, sitä pidempiä ne ovat, ja siksi pisimmät molekyylit liikkuvat hitaimmin ja lyhyimmät - nopeimmin (kuva 2). Ennen elektroforeesia tai sen jälkeen geeliä käsitellään väriaineilla, jotka sitoutuvat DNA:han ja fluoresoivat ultraviolettivalossa, ja geelissä saadaan vyöhykekuvio (katso kuva 3). Näytteessä olevien DNA-fragmenttien pituuksien määrittämiseksi niitä verrataan markkeriin, ts. sarjaan standardipituisia fragmentteja, jotka on kerrostettu rinnakkain samalle geelille (kuvio 4).

Tärkeimmät työkalut DNA:n kanssa työskentelyyn ovat entsyymit, jotka suorittavat DNA-transformaatioita elävissä soluissa: DNA-polymeraasit, DNA-ligaasit ja restriktioendonukleaasit eli restriktioentsyymit. DNA-polymeraasi Suoritetaan DNA-templaattisynteesi, joka mahdollistaa DNA:n lisäämisen koeputkessa. DNA-ligaasit ompele DNA-molekyylejä yhteen tai korjaa niissä olevat aukot. Restriktioendonukleaasit, tai rajoittaa, leikkaa DNA-molekyylejä tiukasti määriteltyjen sekvenssien mukaan, mikä mahdollistaa yksittäisten fragmenttien leikkaamisen DNA:n kokonaismassasta. Nämä fragmentit voivat joissakin tapauksissa sisältää yksittäisiä geenejä.

rajoittaa

Restriktioentsyymien tunnistamat sekvenssit ovat symmetrisiä, ja katkoksia voi tapahtua sellaisen sekvenssin keskellä tai siirtymällä (samassa paikassa molemmissa DNA-juosteissa). Toimintasuunnitelma erilaisia ​​tyyppejä restrikaasi on esitetty kuvassa. 1. Ensimmäisessä tapauksessa saadaan niin sanotut "tylpät" päät ja toisessa - "tahmeat" päät. Pohjan "tahmeiden" päiden tapauksessa ketju on toista lyhyempi, muodostuu yksisäikeinen osa symmetrisellä sekvenssillä, joka on sama molemmissa muodostetuissa päissä.

Päätesekvenssit ovat samat, kun mikä tahansa DNA katkaistaan ​​tietyllä restriktioentsyymillä, ja ne voidaan yhdistää uudelleen, koska niillä on komplementaarisia sekvenssejä. Ne voidaan liittää DNA-ligaasin kanssa yhden molekyylin muodostamiseksi. Siten on mahdollista yhdistää kahden eri DNA:n fragmentteja ja saada ns yhdistelmä-DNA. Tätä lähestymistapaa käytetään molekyylikloonausmenetelmässä, joka mahdollistaa yksittäisten geenien saamisen ja viemisen soluihin, jotka voivat muodostaa geenin koodaaman proteiinin.

molekyylikloonaus

Molekyylikloonaus käyttää kahta DNA-molekyyliä - inserttiä, joka sisältää kiinnostavan geenin, ja vektori- DNA toimii kantajana. Insertti "ommellaan" vektoriin entsyymien avulla, jolloin saadaan uusi, yhdistelmä-DNA-molekyyli, sitten tämä molekyyli viedään isäntäsoluihin, ja nämä solut muodostavat pesäkkeitä ravintoalustalle. Pesäke on yhden solun jälkeläinen eli klooni, kaikki pesäkkeen solut ovat geneettisesti identtisiä ja sisältävät saman rekombinantti-DNA:n. Tästä johtuu termi "molekyylikloonaus", toisin sanoen meitä kiinnostavan DNA-fragmentin sisältävän solukloonin hankkiminen. Kun meitä kiinnostavan insertin sisältävät pesäkkeet on saatu, on mahdollista karakterisoida tämä insertti eri menetelmillä, esimerkiksi määrittää sen tarkka sekvenssi. Solut voivat myös tuottaa insertin koodaamaa proteiinia, jos se sisältää toiminnallisen geenin.

Kun rekombinanttimolekyyli viedään soluihin, tapahtuu näiden solujen geneettinen transformaatio. Muutos- prosessi, jossa organismin solu absorptioi ympäristöstä vapaan DNA-molekyylin ja integroituu genomiin, mikä johtaa siihen, että tällaisessa solussa ilmaantuu uusia periytyviä piirteitä, jotka ovat ominaisia ​​DNA:n luovuttajalle. . Esimerkiksi, jos lisätty molekyyli sisältää geenin, joka on vastustuskykyinen antibiootille ampisilliinille, transformoidut bakteerit kasvavat sen läsnä ollessa. Ennen transformaatiota ampisilliini aiheutti heidän kuolemansa, toisin sanoen transformoituneisiin soluihin ilmestyy uusi merkki.

VEKTORIT

Vektorilla on oltava useita ominaisuuksia:

Ensinnäkin se on suhteellisen pieni DNA-molekyyli, jota on helppo manipuloida.

Toiseksi, jotta DNA säilyisi ja lisääntyisi solussa, sen täytyy sisältää tietty sekvenssi, joka varmistaa sen replikaation (replikaation aloituskohta tai replikaation aloituskohta).

Kolmanneksi sen on sisällettävä markkerigeeni, joka varmistaa vain niiden solujen valinnan, joihin vektori on tullut. Yleensä nämä ovat antibioottiresistenssigeenejä - sitten antibiootin läsnä ollessa kaikki solut, jotka eivät sisällä vektoria, kuolevat.

Geenikloonaus suoritetaan useimmiten bakteerisoluissa, koska niitä on helppo viljellä ja ne lisääntyvät nopeasti. Bakteerisolussa on yleensä yksi suuri pyöreä, useita miljoonia emäspareja pitkä DNA-molekyyli, joka sisältää kaikki bakteereille tarpeelliset geenit - bakteerikromosomi. Sen lisäksi joissakin bakteereissa on pieniä (useita tuhatta emäsparia) pyöreää DNA:ta, ns plasmidit(Kuva 2). Ne, kuten pää-DNA, sisältävät nukleotidisekvenssin, joka tarjoaa DNA:lle kyvyn replikoitua (ori). Plasmidit replikoituvat pääasiallisesta (kromosomaalisesta) DNA:sta riippumatta, joten niitä esiintyy solussa suuria kopioita. Monet näistä plasmideista sisältävät antibioottiresistenssigeenejä, mikä mahdollistaa plasmidia kantavien solujen erottamisen normaaleista soluista. Yleisemmin käytetään plasmideja, joissa on kaksi geeniä, jotka antavat resistenssin kahdelle antibiootille, kuten tetrasykliinille ja amysiliinille. Olla olemassa yksinkertaisia ​​menetelmiä sellaisen plasmidi-DNA:n eristäminen, joka on vapaa bakteerin pääkromosomin DNA:sta.

TRANSGENEESIIN MERKITYS

Geenien siirtymistä organismista toiseen kutsutaan transgeneesi ja sellaiset muunnetut organismit - siirtogeeninen. Geeninsiirtomenetelmää mikrobisoluihin käytetään yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistettujen proteiinivalmisteiden saamiseksi lääketieteelliseen käyttöön, erityisesti ihmisen proteiineja, jotka eivät aiheuta immuunihyljintää - interferoneja, insuliinia ja muita proteiinihormoneja, solujen kasvutekijöitä sekä proteiineja rokotteet. Monimutkaisemmissa tapauksissa, kun proteiinin modifiointi suoritetaan oikein vain eukaryoottisoluissa, käytetään siirtogeenisiä soluviljelmiä tai siirtogeenisiä eläimiä, erityisesti karjaa (pääasiassa vuohia), jotka erittävät tarvittavat proteiinit maitoon tai eristetään proteiineja niiden verestä. . Näin saadaan vasta-aineita, veren hyytymistekijöitä ja muita proteiineja. saatu transgeneesillä viljellyt kasvit jotka kestävät rikkakasvien torjunta-aineita ja tuholaisia ​​ja joilla on muita hyödyllisiä ominaisuuksia. Siirtogeenisiä mikro-organismeja käyttämällä jäteveden puhdistamiseen ja saastumisen torjuntaan on jopa siirtogeenisiä mikrobeja, jotka voivat hajottaa öljyä. Lisäksi siirtogeeniset teknologiat ovat välttämättömiä tieteellinen tutkimus- Biologian kehitystä nykyään ei voida ajatella ilman muunnos- ja geeninsiirtomenetelmien rutiininomaista käyttöä.

molekyylikloonaustekniikka

insertit

Yksittäisen geenin saamiseksi mistä tahansa organismista eristetään siitä kaikki kromosomaalinen DNA ja pilkotaan yhdellä tai kahdella restriktioentsyymillä. Entsyymit valitaan siten, että ne eivät leikkaa meitä kiinnostavaa geeniä, vaan tekevät katkoja sen reunoille ja plasmidi-DNA:ssa yhden katkaisun johonkin resistenssigeeniin esimerkiksi ampisilliinille.

Molekyylikloonausprosessi sisältää seuraavat vaiheet:

Leikkaa ja ompele - yhden rekombinanttimolekyylin rakentaminen insertistä ja vektorista.

Transformaatio on rekombinanttimolekyylin viemistä soluihin.

Valinta - solujen valinta, jotka ovat vastaanottaneet vektorin, jossa on insertti.

leikkaus ja ompeleminen

Plasmidi-DNA:ta käsitellään samoilla restriktioentsyymeillä ja se muuttuu lineaariseksi molekyyliksi, jos valitaan sellainen restriktioentsyymi, joka tuo plasmidiin yhden katkoksen. Tämän seurauksena samat tahmeat päät näkyvät kaikkien tuloksena olevien DNA-fragmenttien päissä. Kun lämpötilaa lasketaan, nämä päät yhdistyvät satunnaisesti ja ligoidaan DNA-ligaasilla (katso kuvio 3).

Saadaan seos koostumukseltaan erilaisia ​​pyöreitä DNA:ita: osa niistä sisältää tietyn DNA-sekvenssin kromosomaalista DNA:ta yhdistettynä bakteeri-DNA:han, toiset sisältävät kromosomaalisen DNA:n fragmentteja toisiinsa liittyneenä ja toiset sisältävät pelkistetyn pyöreän plasmidin tai sen dimeerin. (Kuva 4).

muunnos

Seuraavaksi tämä seos suoritetaan geneettinen transformaatio bakteerit, jotka eivät sisällä plasmideja. Muutos- prosessi, jossa organismin solu absorptioi ympäristöstä vapaan DNA-molekyylin ja integroituu genomiin, mikä johtaa siihen, että tällaisessa solussa ilmaantuu uusia periytyviä piirteitä, jotka ovat ominaisia ​​DNA:n luovuttajalle. . Vain yksi plasmidi voi päästä sisään ja lisääntyä jokaisessa solussa. Tällaiset solut asetetaan kiinteälle ravintoalustalle, joka sisältää antibiootti tetrasykliiniä. Solut, jotka eivät ole saaneet plasmidia, eivät kasva tällä alustalla, ja plasmidia kantavat solut muodostavat pesäkkeitä, joista jokainen sisältää vain yhden solun jälkeläisiä, ts. kaikki solut pesäkkeessä kantavat samaa plasmidia (katso kuvio 5).

Valinta

Seuraavaksi tehtävänä on eristää vain solut, joihin insertin sisältävä vektori on mennyt, ja erottaa ne soluista, joissa on vain vektori ilman inserttiä tai jotka eivät sisällä vektoria ollenkaan. Tätä prosessia oikeiden solujen valitsemiseksi kutsutaan valinta. Tätä varten hae selektiiviset merkit- yleensä antibioottiresistenssigeenit vektorissa, ja valikoiva media jotka sisältävät antibiootteja tai muita selektiivisiä aineita.

Tarkastelemassamme esimerkissä ampisilliinin läsnä ollessa kasvatetuista pesäkkeistä peräisin olevia soluja jatkoviljellään kahdella alustalla: ensimmäinen sisältää ampisilliinia ja toinen tetrasykliiniä. Pesäkkeet, jotka sisältävät vain plasmidin, kasvavat molemmilla elatusaineilla, kun taas pesäkkeet, jotka sisältävät insertoitua kromosomaalista DNA:ta plasmideissa, eivät kasva tetrasykliiniä sisältävällä alustalla (kuvio 5). Niistä ne, jotka sisältävät meitä kiinnostavan geenin, valitaan erityisillä menetelmillä, kasvatetaan riittävästi ja eristetään plasmidi-DNA. Siitä leikataan pois kiinnostava yksittäinen geeni käyttämällä samoja restriktaaseja, joita käytettiin rekombinantti-DNA:n saamiseksi. Tämän geenin DNA:ta voidaan käyttää nukleotidien sekvenssin määrittämiseen, viemiseen mihin tahansa organismiin uusien ominaisuuksien saamiseksi tai halutun proteiinin syntetisoimiseen. Tätä geenieristysmenetelmää kutsutaan molekyylikloonaus.

fluoresoivat proteiinit

On erittäin kätevää käyttää fluoresoivia proteiineja markkerigeeneinä eukaryoottisten organismien tutkimuksissa. Ensimmäisen fluoresoivan proteiinin geeni, vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) eristettiin meduusasta Aqeuorea victoria ja siirrettiin erilaisiin mallieliöihin (katso kuva 6). Vuonna 2008 O. Shimomura, M. Chalfi ja R. Tsien saivat Nobel-palkinnon tämän proteiinin löytämisestä ja soveltamisesta.

Sitten eristettiin muiden fluoresoivien proteiinien - punaisen, sinisen, keltaisen - geenit. Näitä geenejä on modifioitu keinotekoisesti tuottamaan proteiineja, joilla on halutut ominaisuudet. Fluoresoivien proteiinien monimuotoisuus on esitetty kuvassa. 7, jossa on petrimalja, jossa on bakteereja, jotka sisältävät geenejä eri fluoresoiville proteiineille.

fluoresoivien proteiinien käyttö

Fluoresoiva proteiinigeeni voidaan fuusioida minkä tahansa muun proteiinin geeniin, jolloin translaation aikana muodostuu yksi proteiini - translaatiofuusioproteiini tai fuusio(fuusioproteiini), joka fluoresoi. Siten on mahdollista tutkia esimerkiksi minkä tahansa kiinnostavan proteiinin sijaintia (sijaintia) solussa, niiden liikkumista. Ilmentämällä fluoresoivia proteiineja vain tietyissä solutyypeissä on mahdollista leimata tämän tyyppisiä soluja monisoluinen organismi(katso kuva 8 - hiiren aivot, joissa yksittäisillä hermosoluilla on erilaiset värit tietyn fluoresoivien proteiinigeenien yhdistelmän vuoksi). Fluoresoivat proteiinit ovat välttämätön työkalu nykyaikaisessa molekyylibiologiassa.

PCR

Toista menetelmää geenien saamiseksi kutsutaan polymeraasiketjureaktio (PCR). Se perustuu DNA-polymeraasien kykyyn täydentää DNA:n toinen juoste komplementaarista juostetta pitkin, kuten tapahtuu soluissa DNA:n replikaation aikana.

Replikaation alkukohdat tässä menetelmässä saadaan kahdesta pienestä DNA-palasta, joita kutsutaan nimellä siemenet, tai alukkeet. Nämä alukkeet ovat komplementaarisia kiinnostuksen kohteena olevan geenin päille kahdessa DNA-juosteessa. Ensinnäkin kromosomaalinen DNA, josta geeni eristetään, sekoitetaan siementen kanssa ja kuumennetaan 99 °C:seen. Tämä johtaa vetysidosten katkeamiseen ja DNA-säikeiden erottumiseen. Sen jälkeen lämpötila lasketaan noin 50-70 asteeseen (riippuen siementen pituudesta ja järjestyksestä). Näissä olosuhteissa alukkeet kiinnittyvät kromosomaalisen DNA:n komplementaarisiin alueisiin muodostaen säännöllisen kaksoiskierteen (katso kuvio 9). Sen jälkeen lisätään kaikkien neljän DNA-synteesiin tarvittavan nukleotidin ja DNA-polymeraasin seos. Entsyymi pidentää alukkeita rakentamalla kaksijuosteista DNA:ta alukkeiden kiinnityskohdasta, ts. geenin päistä yksijuosteisen kromosomimolekyylin loppuun.

Jos seosta kuumennetaan nyt uudelleen, kromosomaaliset ja vasta syntetisoidut ketjut hajaantuvat. Jäähtymisen jälkeen siemenet liittyvät taas niihin, joita otetaan runsaasti (katso kuva 10).

Äskettäin syntetisoiduissa ketjuissa ne eivät liity siihen päähän, josta ensimmäinen synteesi alkoi, vaan vastakkaiseen, koska DNA-ketjut ovat vastakkaisia. Siksi toisessa synteesisyklissä vain geeniä vastaava sekvenssi valmistuu tällaisissa ketjuissa (katso kuvio 11).

Tämä menetelmä käyttää DNA-polymeraasia termofiilisistä bakteereista, jotka kestävät kiehumista ja toimivat 70-80 °C:n lämpötiloissa, sitä ei tarvitse lisätä joka kerta, mutta riittää, kun se lisätään kokeen alussa. Toistamalla lämmitys- ja jäähdytystoimenpiteet samassa järjestyksessä, voimme kaksinkertaistaa jaksojen lukumäärän kussakin jaksossa, jota molemmista päistä rajoittavat lisätyt siemenet (katso kuva 12).

Noin 25 tällaisen syklin jälkeen geenin kopioiden määrä kasvaa yli miljoona kertaa. Tällaiset määrät voidaan helposti erottaa koeputkeen syötetystä kromosomaalisesta DNA:sta ja käyttää eri tarkoituksiin.

DNA-sekvensointi

Toinen tärkeä saavutus on menetelmien kehittäminen DNA:n nukleotidisekvenssin määrittämiseksi - DNA-sekvensointi(englanninkielisestä sekvenssistä - sekvenssi). Tätä varten on tarpeen saada geenit puhtaina toisesta DNA:sta jollakin kuvatuista menetelmistä. Sitten DNA-ketjut erotetaan kuumentamalla ja niihin lisätään radioaktiivisella fosforilla leimattu aluke tai fluoresoiva leima. Huomaa, että otetaan yksi siemen, joka täydentää yhtä ketjua. Sitten lisätään DNA-polymeraasi ja 4 nukleotidin seos. Tällainen seos jaetaan 4 osaan ja jokaiseen lisätään yksi nukleotideista modifioituna siten, että se ei sisällä hydroksyyliryhmää deoksiriboosin kolmannessa atomissa. Jos tällainen nukleotidi sisältyy syntetisoituun DNA-ketjuun, sen pidentyminen ei voi jatkua, koska polymeraasilla ei ole minnekään kiinnittää seuraavaa nukleotidia. Siksi DNA-synteesi tällaisen nukleotidin sisällyttämisen jälkeen keskeytyy. Näitä nukleotideja, joita kutsutaan dideoksinukleotideiksi, lisätään paljon vähemmän kuin tavallisesti, joten ketjun päättyminen tapahtuu vain satunnaisesti ja jokaisessa ketjussa eri paikoissa. Tuloksena on sekoitus eripituisia ketjuja, joista jokaisen päässä on sama nukleotidi. Siten ketjun pituus vastaa tutkitun sekvenssin nukleotidilukua, esimerkiksi jos meillä oli adenyylidideoksinukleotidi ja tuloksena saadut ketjut olivat 2, 7 ja 12 nukleotidiä pitkiä, niin adeniini oli toisessa, seitsemännessä ja kahdestoista paikassa geeni. Tuloksena oleva ketjuseos voidaan erottaa helposti koon mukaan elektroforeesilla, ja syntetisoidut ketjut voidaan tunnistaa radioaktiivisuudella röntgenfilmillä (katso kuva 10).

Osoittautuu kuvan alareunassa näkyvä kuva, nimeltään radioautograph. Liikkumalla sitä pitkin alhaalta ylös ja lukemalla kunkin vyöhykkeen sarakkeiden yläpuolella olevan kirjaimen, saamme nimikirjoituksen oikealla puolella olevassa kuvassa näkyvän nukleotidisekvenssin. Kävi ilmi, että synteesiä pysäyttävät dideoksinukleotidien lisäksi myös nukleotidit, joissa jokin kemiallinen ryhmä, esimerkiksi fluoresoiva väriaine, on kiinnittynyt sokerin kolmanteen paikkaan. Jos jokainen nukleotidi on leimattu omalla väriaineella, syntetisoidut ketjut erottamalla saadut vyöhykkeet hehkuvat eri valolla. Tämä mahdollistaa reaktion suorittamisen yhdessä koeputkessa samanaikaisesti kaikille nukleotideille ja erottamalla tuloksena olevat ketjut pituuden mukaan, tunnistaa nukleotidit värin perusteella (katso kuva 11).

Tällaiset menetelmät mahdollistivat yksittäisten geenien sekvenssien määrittämisen, mutta myös kokonaisten genomien lukemisen. Vielä nopeampia menetelmiä geenien nukleotidisekvenssien määrittämiseksi on nyt kehitetty. Jos ensimmäinen ihmisgenomi selvitettiin suuressa kansainvälisessä konsortiossa ensimmäisellä annetulla menetelmällä 12 vuodessa, toisella, toisella kolmessa vuodessa, nyt tämä voidaan tehdä kuukaudessa. Näin voit ennustaa henkilön alttiutta monille sairauksille ja ryhtyä toimenpiteisiin etukäteen niiden välttämiseksi.

Biokemian, biofysiikan, genetiikan, sytokemian, monien mikrobiologian ja virologian osa-alueiden kehitys XX vuosisadan 40-luvun alussa. johti tiiviisti elämänilmiöiden tutkimukseen molekyylitasolla. Näiden tieteiden saavuttamat menestykset, samanaikaisesti ja eri puolilta, johtivat sen tosiasian ymmärtämiseen, että kehon tärkeimmät ohjausjärjestelmät toimivat molekyylitasolla ja näiden tieteiden jatkokehitys riippuu paljastuksesta. biologiset toiminnot eliöiden rungot muodostavat molekyylit, niiden osallistuminen synteesiin ja hajoamiseen, yhdisteiden keskinäiset muutokset ja lisääntyminen solussa sekä tässä tapauksessa tapahtuva energian ja tiedon vaihto. Siten näiden biologisten tieteenalojen risteyksessä kemian ja fysiikan kanssa syntyi täysin uusi haara - molekyylibiologia.

Toisin kuin biokemiassa, nykyaikaisen molekyylibiologian huomio keskittyy pääasiassa tärkeimpien biopolymeeriluokkien - proteiinien ja nukleiinihappojen - rakenteen ja toiminnan tutkimukseen, joista ensimmäinen määrää metabolisten reaktioiden mahdollisuuden, ja toinen - tiettyjen proteiinien biosynteesi. Siksi on selvää, että on mahdotonta tehdä selkeää eroa molekyylibiologian ja biokemian, vastaavien genetiikan, mikrobiologian ja virologian aloja, välillä.

Molekyylibiologian syntyminen liittyi läheisesti uusien tutkimusmenetelmien kehittämiseen, joita on jo käsitelty vastaavissa luvuissa. Elektronimikroskopian ja muiden mikroskooppisen tekniikan menetelmien kehittymisen ohella 1950-luvulla kehitetyillä soluelementtien fraktiointimenetelmillä oli tärkeä rooli. Ne perustuivat parannettuihin differentiaalisen sentrifugointimenetelmiin (A. Claude, 1954). Siihen mennessä oli olemassa jo varsin luotettavia menetelmiä biopolymeerien eristämiseen ja fraktiointiin. Tämä sisältää erityisesti A. Tiseluksen (1937; Nobel palkinto 1948) proteiinien fraktiointimenetelmä elektroforeesilla, menetelmät nukleiinihappojen eristämiseksi ja puhdistamiseksi (E. Kay, A. Downs, M. Sevag, A. Mirsky jne.). Samaan aikaan monissa maailman laboratorioissa kehitettiin erilaisia ​​kromatografisen analyysin menetelmiä (A. Martin ja R. Sing, 1941; Nobel-palkinto, 1952), joita myöhemmin parannettiin merkittävästi.

Röntgendiffraktioanalyysillä oli korvaamaton palvelu biopolymeerien rakenteen tulkinnassa. Röntgendiffraktioanalyysin perusperiaatteet kehitettiin King's College London Universityssä W. Braggin johdolla tutkijaryhmässä, johon kuuluivat J. Bernal, A. Londsdale, W. Astbury, J. Robertson ja muut.

Erityisen huomionarvoista on professori Moskovskin tutkimus valtion yliopisto A. R. Kizel protoplasman biokemiasta (1925 - 1929), joilla oli suuri merkitys molekyylibiologian myöhemmän kehityksen kannalta. Kizel teki iskun tiukasti juurtuneelle ajatukselle, että mikä tahansa protoplasma perustuu erityiseen proteiinirunkoon - levyihin, jonka väitetään määräävän kaikki sen tärkeimmät rakenteelliset ja toiminnalliset ominaisuudet. Hän osoitti, että levyt ovat proteiini, jota löytyy vain myksomykeetistä ja sitten tietyssä kehitysvaiheessa, ja että protoplasmassa ei ole pysyvää komponenttia - yksittäistä luustoproteiinia. Siten päädyttiin protoplasman rakenteen ja proteiinien toiminnallisen roolin ongelman tutkimiseen oikea tapa ja sai tilaa sen kehittymiselle. Kiselin tutkimus on saanut maailmanlaajuista tunnustusta ja se on kannustanut kemian opiskelua osat soluja.

Termi "molekyylibiologia", jota käytti ensimmäisen kerran englantilainen kristallografi, Leedsin yliopiston professori W. Astbury, ilmestyi luultavasti 1940-luvun alussa (ennen vuotta 1945). Astburyn 1930-luvulla tekemät proteiinien ja DNA:n perustavanlaatuiset röntgendiffraktiotutkimukset toimivat perustana näiden biopolymeerien sekundaarirakenteen myöhemmälle onnistuneelle purkamiselle. Vuonna 1963 J. Bernal kirjoitti: "Koko molekyylibiologia - tiede, jonka hän nimesi ja jonka hän todella perusti - pystyttää hänelle muistomerkin" * , Kirjallisuudessa tämä termi esiintyi ensimmäisen kerran ehkä vuonna 1946 W. Astburyn artikkelissa "Orgaanisten ja säikeisten yhdisteiden röntgendiffraktioanalyysin edistyminen", julkaistu englanninkielisessä "Nature"-lehdessä**. Astbury (1950) totesi Harvey-luennossaan: "Olen iloinen, että termiä molekyylibiologia käytetään nykyään melko laajalti, vaikka on epätodennäköistä, että olisin ensimmäinen, joka ehdotti sitä. Pidin siitä ja olen pitkään yrittänyt levittää sitä. ”***. Jo vuonna 1950 Astbury oli selvää, että molekyylibiologia käsittelee ensisijaisesti makromolekyylien rakennetta ja konformaatiota, joiden tutkiminen on ratkaisevan tärkeää elävien organismien toiminnan ymmärtämisen kannalta.

* (biogr. Mem. Kaverit Roy. Soc, 1963, v. 9, 29.)

** (W. T. Astbury. Orgaanisten ja kuiturakenteiden röntgenanalyysin edistyminen.- Luonto,. 1946, v. 157, 121.)

*** (W. T. Astbury. Seikkailut sisään Molekyylibiologia. Thomas Springfield, 1952, s. 3.)

Molekyylibiologia on kohdannut ja kohtaa itse asiassa samat tehtävät kuin koko biologia - elämän olemuksen ja erityisesti sen perusilmiöiden, kuten perinnöllisyyden ja vaihtelevuuden, tunteminen. Nykyaikainen molekyylibiologia on ensisijaisesti tarkoitettu geenien rakenteen ja toiminnan, toteutustapojen ja mekanismien tulkitsemiseen geneettistä tietoa organismit ontogeneesin eri vaiheissa ja sen lukemisen eri vaiheissa. Se on suunniteltu paljastamaan geenitoiminnan ja solujen erilaistumisen säätelyn hienovaraiset mekanismit, selventämään mutageneesin luonnetta ja evoluutioprosessin molekyyliperustaa.

Nukleiinihappojen geneettisen roolin määrittäminen

Molekyylibiologian kehittämiseen korkein arvo teki seuraavat löydöt. Vuonna 1944 amerikkalaiset tutkijat O. Avery, K. McLeod (Nobel-palkinto, 1923) ja M. McCarthy osoittivat, että pneumokokeista eristetyillä DNA-molekyylillä on muuntavaa aktiivisuutta. Kun nämä DNA:t oli hydrolysoitu deoksiribonukleaasin vaikutuksesta, niiden transformoiva aktiivisuus katosi kokonaan. Näin ollen ensimmäistä kertaa todistettiin vakuuttavasti, että DNA:lla, ei proteiinilla, on geneettisiä toimintoja solussa.

Rehellisyyden nimissä on huomattava, että bakteeritransformaatioilmiö löydettiin paljon aikaisemmin kuin Averyn, McLeodin ja McCarthyn löytö. Vuonna 1928 F. Griffith julkaisi artikkelin, jossa hän kertoi, että kun kapseloidun virulentin kannan tapettuja soluja oli lisätty ei-virulentteihin (kapseloimattomiin) pneumokokkeihin, tuloksena olevasta soluseoksesta tulee kohtalokas hiirille. Lisäksi tällä seoksella infektoiduista eläimistä eristetyt elävät pneumokokkisolut olivat jo virulentteja ja niissä oli polysakkaridikapseli. Siten tässä kokeessa osoitettiin, että tapettujen pneumokokkisolujen joidenkin komponenttien vaikutuksesta bakteerien kapseloimaton muoto muuttuu kapselin muodostavaksi virulentiksi muodoksi. Kuusitoista vuotta myöhemmin Avery, McLeod ja McCarthy korvasivat tapetut kokonaiset pneumokokkisolut deoksiribonukleiinihapollaan tässä kokeessa ja osoittivat, että DNA:lla oli transformoivaa aktiivisuutta (katso myös luvut 7 ja 25). Tämän löydön merkitystä on vaikea yliarvioida. Se stimuloi nukleiinihappojen tutkimusta monissa laboratorioissa ympäri maailmaa ja pakotti tutkijat keskittymään DNA:han.

Averyn, McLeodin ja McCarthyn löytöjen ohella 50-luvun alkuun mennessä melko monet suuri määrä suoraa ja epäsuoraa näyttöä siitä, että nukleiinihapoilla on poikkeuksellinen rooli elämässä ja niillä on geneettinen tehtävä. Tämän osoittivat erityisesti DNA:n lokalisoinnin luonne solussa ja R. Vendrellin (1948) tiedot, joiden mukaan DNA-pitoisuus solua kohden on tiukasti vakio ja korreloi ploidisuusasteen kanssa: haploidisissa sukusoluissa DNA on puolet diploidisten somaattisten solujen määrästä. DNA:n selvä metabolinen stabiilius osoitti myös DNA:n geneettisen roolin puolesta. 1950-luvun alkuun mennessä oli kertynyt paljon erilaisia ​​faktoja, jotka osoittivat, että useimmat tunnetuista mutageenisista tekijöistä vaikuttavat pääasiassa nukleiinihappoihin ja erityisesti DNA:han (R. Hotchkiss, 1949; G. Ephrussi-Taylor, 1951; E. Freese, 1957 ja muut).

Erityisen tärkeää nukleiinihappojen geneettisen roolin selvittämisessä oli eri faagien ja virusten tutkiminen. Vuonna 1933 D. Schlesinger löysi DNA:ta Escherichia colin bakteriofagista. Sen jälkeen kun W. Stanley (1935, Nobel-palkinto, 1946) eristi tupakan mosaiikkiviruksen (TMV) kiteisessä tilassa, kasvivirusten tutkimuksessa on alkanut uusi vaihe. Vuosina 1937-1938. Rothamsted Agricultural Stationin (Englanti) työntekijät F. Bowden ja N. Peary osoittivat, että monet heidän eristämänsä kasvivirukset eivät ole globuliineja, vaan ribonukleoproteiineja ja sisältävät nukleiinihappoa pakollisena komponenttina. Aivan 40-luvun alussa julkaistiin G. Schrammin (1940), P. A. Agatovin (1941), G. Millerin ja W. Stanleyn (1941) teokset, jotka osoittavat, että proteiinikomponentin havaittava kemiallinen modifikaatio ei johda TMV-tarttuvuuden menetykseen. Tämä osoitti, että proteiinikomponentti ei voinut olla kantaja perinnöllisiä ominaisuuksia virus, kuten monet mikrobiologit uskoivat edelleen. Vuonna 1956 G. Schramm Tübingenissä (Saksa) ja H. Frenkel-Konrath Kaliforniassa (USA) saivat vakuuttavia todisteita nukleiinihapon (RNA) geneettisen roolin puolesta kasviviruksissa. Nämä tutkijat eristivät lähes samanaikaisesti ja toisistaan ​​riippumatta RNA:ta TMV:stä ja osoittivat, että sillä, ei proteiinilla, on tarttuvuus: tupakkakasvien infektion seurauksena tällä RNA:lla muodostui ja lisääntyi niissä normaaleja viruspartikkeleita. Tämä tarkoitti, että RNA sisälsi informaatiota kaikkien viruskomponenttien synteesiä ja kokoamista varten, mukaan lukien virusproteiini. Vuonna 1968 I. G. Atabekov totesi, että proteiinilla on merkittävä rooli kasvien tartunnassa - proteiinin luonne määrää isäntäkasvien kirjon.

Vuonna 1957 Frenkel-Konrat suoritti ensimmäistä kertaa TMV:n rekonstruoinnin sen komponenteista - RNA:sta ja proteiineista. Normaalien hiukkasten ohella hän sai sekoitettuja "hybridejä", joissa RNA oli yhdestä kannasta ja proteiini toisesta. Tällaisten hybridien perinnöllisyyden määritti täysin RNA, ja virusten jälkeläiset kuuluivat siihen kantaan, jonka RNA:ta käytettiin alkuperäisten sekahiukkasten saamiseksi. Myöhemmin A. Giererin, G. Schusterin ja G. Schrammin (1958) ja G. Witmanin (1960 - 1966) kokeet osoittivat, että TMV:n nukleiinikomponentin kemiallinen modifikaatio johtaa tämän viruksen erilaisten mutanttien ilmaantumiseen.

Vuonna 1970 D. Baltimore ja G. Temin havaitsivat, että geneettisen tiedon siirtyminen ei voi tapahtua vain DNA:sta RNA:han, vaan päinvastoin. He löysivät joistakin onkogeenisistä RNA:ta sisältävistä viruksista (oncornaviruksista) erityisen entsyymin, niin sanotun käänteiskopioijaentsyymin, joka pystyy syntetisoimaan komplementaarista DNA:ta RNA-ketjuissa. Tämä suuri löytö mahdollisti RNA:ta sisältävien virusten geneettisen tiedon liittämisen mekanismin isäntägenomiin ja tarkastelun uudelleen niiden onkogeenisen vaikutuksen luonteeseen.

Nukleiinihappojen löytäminen ja niiden ominaisuuksien tutkiminen

Termin nukleiinihapot otti käyttöön saksalainen biokemisti R. Altman vuonna 1889, sen jälkeen kun sveitsiläinen lääkäri F. Miescher löysi nämä yhdisteet vuonna 1869. Misher uutti mätäsoluja laimealla kloorivetyhapolla useiden viikkojen ajan ja sai lähes puhdasta ydinmateriaalia loppuosasta. Hän piti tätä materiaalia tyypillisenä "solujen ytimien aineena ja kutsui sitä nukleiiniksi. Nukleiini erosi ominaisuuksiltaan jyrkästi proteiineista: se oli happamampaa, ei sisältänyt rikkiä, mutta se sisälsi paljon fosforia, se oli helposti liukeneva alkaleissa, mutta ei liuennut laimeisiin happoihin.

Misher lähetti nukleiinihavaintojensa tulokset F. Goppe-Seylerille julkaistavaksi lehdessä. Hänen kuvaamansa aine oli niin epätavallinen (tuohon aikaan kaikista biologisista fosforia sisältävistä yhdisteistä tiedettiin vain lesitiini), että Goppe-Seyler ei uskonut Misherin kokeita, palautti käsikirjoituksen hänelle ja käski työntekijöitään N. Ploshia ja N. Lyubavinia tarkista hänen johtopäätöksensä muusta materiaalista. Miescherin teos "Märkäsolujen kemiallisesta koostumuksesta" julkaistiin kaksi vuotta myöhemmin (1871). Samaan aikaan julkaistiin Goppe-Seylerin ja hänen työtovereidensa teoksia mätäsolujen, lintujen, käärmeiden ja muiden solujen erytrosyyttien koostumuksesta. Seuraavien kolmen vuoden aikana nukleiinia eristettiin eläinsoluista ja hiivasta.

Misher totesi työssään, että eri nukleiinien yksityiskohtainen tutkimus voi johtaa erojen muodostumiseen niiden välillä, mikä ennakoi ajatusta nukleiinihappojen spesifisyydestä. Lohimaitoa tutkiessaan Misher havaitsi, että niissä oleva nukleiini on suolan muodossa ja liittyy pääproteiiniin, jota hän kutsui protamiiniksi.

Vuonna 1879 A. Kossel alkoi tutkia nukleiineja Goppe-Seylerin laboratoriossa. Vuonna 1881 hän eristi hypoksantiinia nukleiinista, mutta tuolloin hän vielä epäili tämän emäksen alkuperää ja uskoi, että hypoksantiini voisi olla proteiinien hajoamistuote. Vuonna 1891 Kossel löysi nukleiinihydrolyysituotteista adeniinin, guaniinin, fosforihapon ja toisen aineen, jolla oli sokerin ominaisuuksia. Nukleiinihappojen kemian tutkimuksesta Kosselille myönnettiin Nobel-palkinto vuonna 1910.

Jatkokehitys nukleiinihappojen rakenteen selvittämisessä liittyy P. Levinin ja kollegoiden (1911 - 1934) tutkimukseen. Vuonna 1911 P. Levin ja V. Jacobs tunnistivat adenosiinin ja guanosiinin hiilihydraattikomponentin; he havaitsivat, että nämä nukleosidit sisältävät D-riboosia. Vuonna 1930 Lewin osoitti, että deoksiribonukleosidien hiilihydraattikomponentti on 2-deoksi-D-riboosi. Hänen työstään tuli tiedoksi, että nukleiinihapot rakennetaan nukleotideista eli fosforyloiduista nukleosideista. Levin uskoi, että nukleiinihappojen (RNA) pääasiallinen sidostyyppi on 2", 5" fosfodiesterisidos. Tämä käsitys osoittautui vääräksi. Englantilaisen kemistin A. Toddin (Nobel-palkinto, 1957) ja hänen työtovereidensa sekä englantilaisten biokemistien R. Markhamin ja J. Smithin työn ansiosta tuli tunnetuksi 50-luvun alussa, että RNA:n pääasiallinen sidostyyppi on 3", 5" - fosfodiesterisidos.

Lewin osoitti, että eri nukleiinihapot voivat poiketa hiilihydraattikomponentin luonteesta: jotkut niistä sisältävät sokerideoksiriboosia, kun taas toiset sisältävät riboosia. Lisäksi nämä kaksi nukleiinihappotyyppiä erosivat toisen emäksen luonteesta: pentoosityyppiset nukleiinihapot sisälsivät urasiilia ja deoksipentoosityyppiset nukleiinihapot sisälsivät tymiiniä. Deoksipentoosinukleiinihappoa (nykyaikaisessa terminologiassa deoksiribonukleiinihappo - DNA) eristettiin yleensä helposti suuria määriä vasikoiden kateenkorvasta (makea rauhanen). Siksi sitä kutsuttiin tymonukleiinihapoksi. Pentoosityyppisen nukleiinihapon (RNA) lähde oli pääasiassa hiiva ja vehnänalkio. Tätä tyyppiä kutsuttiin usein hiivan nukleiinihapoksi.

1930-luvun alussa käsitys, että kasvisoluille on ominaista hiivatyyppinen nukleiinihappo, juurtui melko vahvasti, kun taas tymonukleiinihappo oli ominaista vain eläinsolujen ytimille. Näitä kahta nukleiinihappotyyppiä, RNA:ta ja DNA:ta, kutsuttiin sitten kasvi- ja eläinnukleiinihapoiksi, vastaavasti. Kuten A. N. Belozerskyn varhaiset tutkimukset osoittivat, tällainen nukleiinihappojen jako on kuitenkin perusteeton. Vuonna 1934 Belozersky löysi ensimmäisen kerran tymonukleiinihapon vuonna 1934 kasvisolut: herneen taimista hän eristi ja tunnisti DNA:lle ominaisen tymiini-pyrimidiiniemäksen. Sitten hän löysi tymiinin muista kasveista (soijapapujen siemenistä, papuista). Vuonna 1936 A. N. Belozersky ja I. I. Dubrovskaya eristivat DNA:ta preparatiivisesti hevoskastanjan taimista. Lisäksi sarja D. Davidsonin ja työtovereiden Englannissa 1940-luvulla suorittamia tutkimuksia osoitti vakuuttavasti, että kasvinukleiinihappoa (RNA) on monissa eläinsoluissa.

R. Felgenin ja G. Rosenbeckin (1924) kehittämän sytokemiallisen reaktion laajalle levinneelle DNA:lle sekä J. Brachetin (1944) reaktiolle RNA:lle on mahdollista ratkaista nopeasti ja yksiselitteisesti kysymys näiden nukleiinien ensisijaisesta sijainnista. hapot solussa. Kävi ilmi, että DNA on keskittynyt ytimeen, kun taas RNA on pääasiassa keskittynyt sytoplasmaan. Myöhemmin havaittiin, että RNA:ta on sekä sytoplasmassa että tumassa, ja lisäksi tunnistettiin sytoplasminen DNA.

Mitä tulee kysymykseen nukleiinihappojen primäärirakenteesta, 1940-luvun puoliväliin mennessä tieteessä vakiintui P. Levinin ajatus, jonka mukaan kaikki nukleiinihapot rakentuvat saman tyypin mukaan ja koostuvat samasta ns. tetranukleotidistä. lohkot. Jokainen näistä lohkoista sisältää Lewinin mukaan neljä erilaista nukleotidia. Nukleiinihappojen rakenteen tetranukleotiditeoria riisti suurelta osin näiltä biopolymeereilta spesifisyyden. Siksi ei ole yllättävää, että tuolloin kaikki elävien olentojen erityispiirteet liittyivät vain proteiineihin, joiden monomeerien luonne on paljon monipuolisempi (20 aminohappoa).

Ensimmäinen aukko nukleiinihappojen tetranukleotidirakenteen teoriassa tehtiin englantilaisen kemistin J. Goulandin (1945 - 1947) analyyttisten tietojen perusteella. Kun hän määritti nukleiinihappojen koostumuksen emästypellä, hän ei saanut emästen ekvimolaarista suhdetta, kuten sen olisi pitänyt olla Lewinin teorian mukaan. Lopuksi tetranukleotiditeoria nukleiinihappojen rakenteesta romahti E. Chargaffin ja hänen työtovereidensa (1949 - 1951) tutkimuksen seurauksena. Chargaff käytti paperikromatografiaa erottamaan DNA:sta sen happohydrolyysin seurauksena vapautuneet emäkset. Jokainen näistä emäksistä määritettiin tarkasti spektrofotometrisesti. Chargaff havaitsi merkittäviä poikkeamia emästen ekvimolaarisesta suhteesta eri alkuperää olevassa DNA:ssa ja totesi ensimmäistä kertaa ehdottomasti, että DNA:lla on selvä lajispesifisyys. Tämä lopetti proteiinispesifisyyden käsitteen hegemonia elävässä solussa. Analysoimalla eri alkuperää olevaa DNA:ta Chargaff löysi ja muotoili ainutlaatuisia DNA-koostumusmalleja, jotka tulivat tieteeseen Chargaffin sääntöjen nimellä. Näiden sääntöjen mukaan kaikessa DNA:ssa alkuperästä riippumatta adeniinin määrä on yhtä suuri kuin tymiinin määrä (A = T), guaniinin määrä on yhtä suuri kuin sytosiinin määrä (G = C), puriinien määrä on yhtä suuri kuin pyrimidiinien määrä (G + A = C + T), emästen määrä 6-aminoryhmillä on yhtä suuri kuin emästen määrä 6-ketoryhmillä (A + C = G + T). Samaan aikaan, huolimatta niin tiukoista kvantitatiivisista vastaavuuksista, eri lajien DNA:ssa eroaa A+T:G+C-suhteen arvo. Joissakin DNA:ssa guaniinin ja sytosiinin määrä hallitsee adeniinin ja tymiinin määrää (Chargaff kutsui näitä DNA:ta GC-tyypin DNA:ksi); muut DNA:t sisälsivät enemmän adeniinia ja tymiiniä kuin guaniini ja sytosiini (näitä DNA:ita kutsuttiin AT-tyypin DNA:ksi). Chargaffin saamilla tiedoilla DNA:n koostumuksesta oli poikkeuksellinen rooli molekyylibiologiassa. J. Watsonin ja F. Crickin vuonna 1953 tekemän DNA:n rakenteen löydön perustana olivat ne.

Jo vuonna 1938 W. Astbury ja F. Bell osoittivat röntgendiffraktioanalyysiä käyttäen, että DNA:n perustasojen tulisi olla kohtisuorassa molekyylin pitkää akselia vastaan ​​ja muistuttavat ikään kuin päällekkäin olevaa levypinoa. toisistaan. Röntgendiffraktioanalyysin tekniikan parantamisen myötä vuoteen 1952 - 1953 mennessä. kertynyt tieto, jonka avulla oli mahdollista arvioida yksittäisten sidosten pituutta ja kaltevuuskulmia. Tämä mahdollisti suurimmalla todennäköisyydellä DNA-molekyylin sokeri-fosfaattirungon pentoositähteiden renkaiden orientaation luonteen esittämisen. Vuonna 1952 S. Farberg ehdotti kahta spekulatiivista DNA-mallia, jotka edustivat yksijuosteista molekyyliä laskostettuna tai kiertyneenä itsensä päälle. L. Pauling (Nobel-palkinnon voittaja, 1954) ja R. Corey ehdottivat vuonna 1953 yhtä spekulatiivista mallia DNA:n rakenteesta. Tässä mallissa kolme kierrettyä DNA-juostetta muodostivat pitkän kierteen, jonka ydintä edusti fosfaattiryhmät ja emäkset sijaitsivat sen ulkopuolella. Vuoteen 1953 mennessä M. Wilkins ja R. Franklin saivat selkeämmät DNA:n röntgendiffraktiokuvioita. Heidän analyysinsä osoitti Farbergin, Paulingin ja Coreyn mallien täydellisen epäonnistumisen. Käyttämällä Chargaffin tietoja, vertaamalla yksittäisten monomeerien molekyylimallien eri yhdistelmiä ja röntgendiffraktiotietoja, J. Watson ja F. Crick tulivat vuonna 1953 siihen johtopäätökseen, että DNA-molekyylin on oltava kaksijuosteinen heliksi. Chargaffin säännöt rajoittivat voimakkaasti mahdollisten järjestettävien emäsyhdistelmien määrää ehdotetussa DNA-mallissa; he ehdottivat Watsonille ja Crickille, että DNA-molekyylissä täytyy olla tietty emäspariutuminen - adeniini tymiinin kanssa ja guaniini sytosiinin kanssa. Toisin sanoen adeniini toisessa DNA-juosteessa vastaa aina tiukasti toisen juosteen tymiiniä, ja yhden juosteen guaniini vastaa välttämättä toisen juosteen sytosiinia. Siten Watson ja Crick muotoilivat ensimmäisinä DNA:n komplementaarisen rakenteen äärimmäisen tärkeän periaatteen, jonka mukaan yksi DNA-juoste täydentää toista, eli yhden juosteen emässekvenssi määrittää yksiselitteisesti toisen (komplementaarisen) juosteen emässekvenssin. . Kävi ilmeiseksi, että jo DNA:n rakenteessa on potentiaali sen tarkalle lisääntymiselle. Tämä DNA-rakenteen malli on tällä hetkellä yleisesti hyväksytty. Crick, Watson ja Wilkins saivat Nobel-palkinnon vuonna 1962 DNA:n rakenteen tulkinnasta.

On huomattava, että ajatus mekanismista makromolekyylien tarkkaan lisääntymiseen ja perinnöllisen tiedon välittämiseen syntyi maastamme. Vuonna 1927 N. K. Koltsov ehdotti, että solujen lisääntymisen aikana molekyylien lisääntyminen tapahtuu olemassa olevien emomolekyylien tarkalla autokatalyyttisellä lisääntymisellä. Totta, tuolloin Koltsov ei varustanut tätä ominaisuutta DNA-molekyylillä, vaan proteiiniluonteisilla molekyyleillä, joiden toiminnallista merkitystä ei silloin tiedetty. Siitä huolimatta idea makromolekyylien autokatalyyttisestä lisääntymisestä ja perinnöllisten ominaisuuksien välittymismekanismista osoittautui profeetalliseksi: siitä tuli modernin molekyylibiologian ohjaava ajatus.

A. N. Belozerskyn laboratoriossa A. S. Spirinin, G. N. Zaitsevan, B. F. Vanyushinin, S. O. Urysonin, A. S. Antonovin ja muiden erilaisten organismien suorittama tutkimus vahvisti täysin Chargaffin löytämät mallit ja täydellisen noudattamisen Watsonin ehdottaman DNA:n rakenteen molekyylimallin kanssa. ja Crick. Nämä tutkimukset ovat osoittaneet, että erilaisten bakteerien, sienten, levien, aktinomykeettien, korkeampia kasveja, selkärangattomilla ja selkärankaisilla on koostumusspesifisyys. Erot koostumuksessa (AT-emäsparien pitoisuudessa) ovat erityisen selkeitä mikro-organismeissa, mikä osoittautuu tärkeäksi taksonomiseksi piirteeksi. Korkeammissa kasveissa ja eläimissä lajien vaihtelut DNA:n koostumuksessa ovat paljon vähemmän ilmeisiä. Mutta tämä ei tarkoita, että heidän DNA:nsa olisi vähemmän spesifinen. Emästen koostumuksen lisäksi spesifisyyden määrää suurelta osin niiden sekvenssi DNA-ketjuissa.

Tavallisten emästen lisäksi DNA:sta ja RNA:sta löydettiin lisää typpipitoisia emäksiä. Siten G. White (1950) löysi 5-metyylisytosiinia kasvien ja eläinten DNA:sta ja D. Dunn ja J. Smith (1958) löysi metyloituneen adeniinin jostakin DNA:sta. Pitkään metyylisytosiinia pidettiin korkeampien organismien geneettisen materiaalin tunnusmerkkinä. Vuonna 1968 A. N. Belozersky, B. F. Vanyushin ja N. A. Kokurina havaitsivat, että se löytyy myös bakteerien DNA:sta.

Vuonna 1964 M. Gold ja J. Hurwitz löysivät uuden luokan entsyymejä, jotka suorittavat DNA:n luonnollisen muuntamisen - sen metyloinnin. Tämän löydön jälkeen kävi selväksi, että vähäisiä (pieniä määriä sisältäviä) emäksiä syntyy jo valmiissa DNA:n polynukleotidiketjussa sytosiini- ja adeniinitähteiden spesifisen metylaation seurauksena erityisissä sekvensseissä. Erityisesti B. F. Vanyushinin, Ya. I. Buryanovin ja A. N. Belozerskyn (1969) mukaan adeniinin metylaatiota E. colin DNA:ssa voi tapahtua päätekodoneissa. A. N. Belozerskyn ja kollegoiden (1968 - 1970) sekä M. Meselsonin (USA) ja V. Arberin (Sveitsi) (1965 - 1969) mukaan metylaatio antaa ainutlaatuisia yksilöllisiä piirteitä DNA-molekyyleille ja yhdessä spesifiset nukleaasit, on osa monimutkaista mekanismia, joka ohjaa DNA:n synteesiä solussa. Toisin sanoen tietyn DNA:n metylaation luonne määrää ennalta kysymyksen siitä, voiko se lisääntyä tietyssä solussa.

Melkein samaan aikaan alkoi DNA-metylaasien ja restriktioendonukleaasien eristäminen ja intensiivinen tutkimus; vuosina 1969-1975 nukleotidisekvenssit, jotka jotkut näistä entsyymeistä tunnistavat DNA:ssa, on vahvistettu (X. Boyer, X. Smith, S. Lynn, K. Murray). Kun restriktioentsyymi hydrolysoi erilaisia ​​DNA:ita, melko suuria fragmentteja, joilla on identtiset "tahmeat" päät, leikataan pois. Tämä tekee mahdolliseksi paitsi analysoida geenien rakennetta, kuten tehdään pienissä viruksissa (D. Nathans, S. Adler, 1973 - 1975), vaan myös rakentaa erilaisia ​​genomeja. Näiden spesifisten restriktioentsyymien löytämisen myötä geenitekniikasta on tullut konkreettista todellisuutta. Pieniin plasmidi-DNA:han upotettuina eri alkuperää olevia geenejä viedään jo helposti sisään erilaisia ​​soluja. Siten saatiin uudentyyppisiä biologisesti aktiivisia plasmideja, jotka antoivat resistenssin tietyille antibiooteille (S. Cohen, 1973), sammakon ja Drosophilan ribosomaaliset geenit vietiin Escherichia coli -plasmideihin (J. Morrow, 1974; X. Boyer, D Hogness, R. Davis, 1974-1975). Siten todelliset tavat ovat avoinna perustavanlaatuisten uusien organismien saamiseksi tuomalla ja integroimalla erilaisia ​​geenejä niiden geenipooliin. Tämä löytö voidaan suunnata koko ihmiskunnan hyödyksi.

Vuonna 1952 G. White ja S. Cohen havaitsivat, että T-paaristen faagien DNA sisältää epätavallisen emäksen - 5-hydroksimetyylisytosiinia. Myöhemmin E. Volkinin ja R. Sinsheimerin (1954) ja Cohenin (1956) teoksista tuli tiedoksi, että hydroksimetyylisytosiinitähteet voivat glukosidoitua kokonaan tai osittain, minkä seurauksena faagi-DNA-molekyyli on suojattu hydrolyyttiseltä vaikutukselta. nukleaaseista.

1950-luvun alussa D. Dunnin ja J. Smithin (Englanti), S. Zamenhofin (USA) ja A. Wackerin (Saksa) teoksista tuli tunnetuksi, että DNA:han voidaan sisällyttää monia keinotekoisia emäsanalogeja, jotka joskus korvaavat. jopa 50 % tymiiniä. Yleensä nämä substituutiot johtavat virheisiin DNA:n replikaatiossa, transkriptiossa ja translaatiossa sekä mutanttien ilmaantumiseen. Siten J. Marmur (1962) havaitsi, että joidenkin faagien DNA sisältää oksimetyyliurasiilia tymiinin sijasta. Vuonna 1963 I. Takahashi ja J. Marmur havaitsivat, että yhden faagin DNA sisältää urasiilia tymiinin sijasta. Siten toinen periaate, jonka mukaan nukleiinihapot erotettiin aiemmin, romahti. P. Levinin teoksista lähtien sen on uskottu tunnusmerkki DNA on tymiini ja RNA on urasiili. Kävi selväksi, että tämä merkki ei ole aina luotettava, ja perustavanlaatuinen ero näiden kahden tyyppisten nukleiinihappojen kemiallisessa luonteessa, kuten nykyään näyttää, on vain hiilihydraattikomponentin luonne.

Faagien tutkimuksessa on paljastettu monia epätavallisia piirteitä nukleiinihappojen järjestäytymisestä. Vuodesta 1953 lähtien on uskottu, että kaikki DNA on kaksijuosteisia lineaarisia molekyylejä, kun taas RNA on vain yksijuosteinen. Tämä asema järkyttyi merkittävästi vuonna 1961, kun R. Sinsheimer havaitsi, että faagin φ X 174 DNA:ta edustaa yksijuosteinen pyöreä molekyyli. Myöhemmin kuitenkin kävi ilmi, että tässä muodossa tämä DNA on olemassa vain vegetatiivisessa faagipartikkelissa, ja myös tämän faagin DNA:n replikatiivinen muoto on kaksijuosteinen. Lisäksi osoittautui melko odottamattomaksi, että joidenkin virusten RNA voi olla kaksijuosteinen. P. Gomatos, I. Tamm ja muut tutkijat löysivät tämän uudenlaisen RNA:n makromolekyyliorganisaation vuonna 1962 joissakin eläinviruksissa ja kasvien haavatuumoriviruksessa. Äskettäin V. I. Agol ja A. A. Bogdanov (1970) totesivat, että lineaaristen RNA-molekyylien lisäksi on myös suljettuja tai syklisiä molekyylejä. He havaitsivat syklistä kaksijuosteista RNA:ta erityisesti. X. Deveaux'n, L. Tinokon, T. I. Tikhonenkon, E. I. Budovskin ja muiden (1960 - 1974) töiden ansiosta bakteriofagien geneettisen materiaalin organisoinnin (laskemisen) pääpiirteet tulivat tunnetuiksi.

Amerikkalainen tiedemies P. Doty havaitsi 1950-luvun lopulla, että kuumennus aiheuttaa DNA:n denaturoitumista, johon liittyy vetysidosten katkeaminen emäsparien välillä ja komplementaaristen ketjujen erottuminen. Tällä prosessilla on "spiraalikela"-faasisiirtymä ja se muistuttaa kiteiden sulamista. Siksi Doty kutsui DNA:n DNA:n lämpödenaturaatioprosessia sulamiseksi. Hitaalla jäähdytyksellä tapahtuu molekyylien renaturaatiota, eli komplementaaristen puoliskojen yhdistymistä.

J. Marmur ja K. Schildkraut käyttivät vuonna 1960 renaturaatioperiaatetta eri mikro-organismien DNA:n "hybridisoituvuuden" määrittämiseen. Myöhemmin E. Bolton ja B. McCarthy paransivat tätä tekniikkaa ehdottamalla niin kutsuttujen DNA-agar-kolonnien menetelmää. Tämä menetelmä osoittautui välttämättömäksi tutkittaessa eri DNA:n nukleotidisekvenssien homologiaastetta ja selvitettäessä eri organismien geneettisiä suhteita. Dotyn löytämä DNA:n denaturaatio yhdistettynä J. Mandelin ja A. Hersheyn* (1960) kuvaamaan metyloidulla albumiinilla suoritettavaan kromatografiaan ja sentrifugointiin tiheysgradientissa (menetelmän kehittivät vuonna 1957 M. Meselson, F. Stahl ja D. Winograd) käytetään laajalti yksittäisten komplementaaristen DNA-säikeiden erottamiseen, eristämiseen ja analysointiin. Esimerkiksi W. Shibalsky (USA) osoitti vuosina 1967-1969, että W. Shibalsky (USA) käyttää näitä tekniikoita lambda-faagin DNA:n erottamiseen. geneettisesti aktiivinen, eikä yksi, kuten tämän katsottiin olevan (S. Spiegelman, 1961). On huomattava, että SE Bresler (1961) ilmaisi ensimmäistä kertaa ajatuksen lambda-faagin molempien DNA-juosteiden geneettisestä merkityksestä Neuvostoliitossa.

* (Bakteerien ja virusten genetiikkaa koskevasta työstään A. Hershey, yhdessä M. Delbrückin ja S. Lurian kanssa, sai Nobel-palkinnon vuonna 1969.)

Genomin organisaation ja toiminnallisen aktiivisuuden ymmärtämiseksi DNA-nukleotidisekvenssin määrittäminen on ensiarvoisen tärkeää. Tällaista määritysmenetelmiä etsitään monissa laboratorioissa ympäri maailmaa. 1950-luvun lopulta lähtien M. Beer ja hänen työtoverinsa ovat yrittäneet määrittää DNA-sekvenssiä elektronimikroskopian avulla Yhdysvalloissa, mutta toistaiseksi tuloksetta. 1950-luvun alussa Sinsheimerin, Chargaffin ja muiden DNA:n entsymaattista hajoamista koskevien tutkijoiden ensimmäisistä töistä tuli tiedoksi, että DNA-molekyylin eri nukleotidit jakautuvat, vaikkakaan ei satunnaisesti, vaan epätasaisesti. Englantilaisen kemistin C. Bartonin (1961) mukaan pyrimidiinit (yli 70 %) konsentroituvat pääasiassa vastaavien lohkojen muodossa. A. L. Mazin ja B. F. Vanyushin (1968 - 1969) havaitsivat, että eri DNA:illa on eriasteinen pyrimidiinikoheesio ja että eläinorganismien DNA:ssa se kasvaa huomattavasti, kun se siirtyy alemmasta korkeampaan. Siten organismien evoluutio heijastuu myös niiden genomien rakenteeseen. Siksi evoluutioprosessin kokonaisuuden ymmärtämiseksi nukleiinihappojen rakenteen vertaileva tutkimus on erityisen tärkeää. Biologisesti tärkeiden polymeerien ja ennen kaikkea DNA:n rakenteen analyysi on erittäin tärkeä monien fylogeneettisten ja taksonomian erityisongelmien ratkaisemiseksi.

On mielenkiintoista huomata, että englantilainen fysiologi E. Lankester, joka tutki nilviäisten hemoglobiineja, ennakoi molekyylibiologian ajatuksia tasan 100 vuotta sitten, kirjoitti: "Eri lajien ja eläin- ja kasvisukujen kemialliset erot ovat samat. merkitys Selvittää niiden alkuperähistoriaa sekä niiden muotoeroja. Jos pystyisimme selkeästi toteamaan erot organismien molekyyliorganisaatiossa ja toiminnassa, pystyisimme ymmärtämään eri organismien alkuperää ja kehitystä paljon paremmin kuin morfologisten havaintojen perusteella "*. Biokemiallisten tutkimusten merkitys systematiikan kannalta oli myös korosti V. L. Komarov, joka kirjoitti, että "kaiken ytimessä jopa puhdas morfologiset ominaisuudet, jonka perusteella luokittelemme ja määritämme lajit, ovat juuri biokemialliset erot" ** .

* (E. R. Lankester. Uber das Vorcommen von Hemoglobin in den Muskeln der Mollusken und die Verbreitung desselben in den lebendigen Organismen. - "Pfluger" s Archiv fur die gesammte Physiol., 1871, Bd 4, 319.)

** (V. L. Komarov. Valitut teokset, osa 1. M.-L., Neuvostoliiton tiedeakatemian kustanta, 1945, s. 331.)

A. V. Blagoveštšenski ja S. L. Ivanov ottivat 1920-luvulla ensimmäiset askeleet maassamme selvittääkseen tiettyjä organismien evoluutiota ja systematiikkaa koskevia kysymyksiä niiden biokemiallisen koostumuksen vertailevan analyysin perusteella (katso luku 2). Vertaileva analyysi proteiinien ja nukleiinihappojen rakenteesta on nyt tulossa taksonomistien yhä konkreettisempi työkalu (ks. luku 21). Tämä molekyylibiologian menetelmä ei mahdollista vain yksittäisten lajien aseman selvittämistä järjestelmässä, vaan tekee myös tarpeelliseksi tarkastella uudelleen organismien luokittelun periaatteita ja joskus tarkistaa koko järjestelmää kokonaisuutena. tapahtui esimerkiksi mikro-organismien systematiikan kanssa. Epäilemättä tulevaisuudessa genomin rakenteen analyysi tulee olemaan keskeinen paikka organismien kemosysteemitiikassa.

Suuri merkitys molekyylibiologian kehitykselle oli DNA:n replikaation ja transkription mekanismien purkaminen (ks. luku 24).

Proteiinin biosynteesi

Tärkeä muutos proteiinien biosynteesin ongelman ratkaisemisessa liittyy nukleiinihappojen tutkimuksen edistymiseen. Vuonna 1941 T. Kasperson (Ruotsi) ja vuonna 1942 J. Brachet (Belgia) kiinnittivät huomiota siihen, että kudokset, joissa on aktiivinen proteiinisynteesi, sisältävät lisääntyneen määrän RNA:ta. He päättelivät, että ribonukleiinihapoilla on ratkaiseva rooli proteiinisynteesissä. Vuonna 1953 E. Gale ja D. Fox näyttävät saaneen suoraa näyttöä RNA:n suorasta osallisuudesta proteiinien biosynteesiin: heidän tietojensa mukaan ribonukleaasi tukahdutti merkittävästi aminohappojen liittymistä bakteerisolulysaatteihin. Samanlaisia ​​tietoja saivat V. Olfri, M. Delhi ja A. Mirsky (1953) maksahomogenaateista. Myöhemmin E. Gale hylkäsi ilmaisemansa oikean ajatuksen RNA:n johtavasta roolista proteiinisynteesissä uskoen virheellisesti, että aktivointi proteiinisynteesi soluvapaassa järjestelmässä tapahtui jonkin muun tuntemattoman aineen vaikutuksen alaisena. Vuonna 1954 P. Zamechnik, D. Littlefield, R. B. Khesin-Lurie ja muut havaitsivat, että aminohappojen aktiivisin sisällyttäminen tapahtuu solunvälisten hiukkasten RNA-rikkaissa fraktioissa - mikrosomeissa. P. Zamechnik ja E. Keller (1953 - 1954) havaitsivat, että aminohappojen sisällyttäminen tehostui huomattavasti supernatantin läsnä ollessa ATP:n regeneraation olosuhteissa. P. Sikevitz (1952) ja M. Hoagland (1956) eristivät supernatantista proteiinifraktion (pH 5 -fraktio), joka oli vastuussa aminohappojen mikrosomeihin sisällyttämisen terävästä stimulaatiosta. Proteiinien ohella supernatantista löydettiin erityinen luokka matalan molekyylipainon RNA:ita, joita nykyään kutsutaan siirto-RNA:iksi (tRNA:iksi). Vuonna 1958 Hoagland ja Zamechnik sekä P. Berg, R. Sweet ja F. Allen sekä monet muut tutkijat havaitsivat, että jokainen aminohappo vaatii oman erityisen entsyyminsä, ATP:n ja spesifisen tRNA:n aktivoituakseen. Kävi selväksi, että tRNA:t suorittavat yksinomaan adapterien, eli laitteiden, jotka löytävät paikan nukleiinimatriisissa (mRNA) vastaavalle aminohapolle nousevassa proteiinimolekyylissä. Nämä tutkimukset vahvistivat täysin F. Crickin (1957) adapterihypoteesin, jonka mukaan solussa oli polynukleotidisovittimia, jotka ovat välttämättömiä syntetisoidun proteiinin aminohappotähteiden oikealle järjestämiselle nukleiinimatriisissa. Paljon myöhemmin ranskalainen tiedemies F. Chapville (1962) F. Lipmanin laboratoriossa (Nobel-palkinto, 1953) Yhdysvalloissa osoitti erittäin nerokkaasti ja yksiselitteisesti, että aminohapon sijainti syntetisoidussa proteiinimolekyylissä määräytyy täysin spesifinen tRNA, johon se on kiinnittynyt. Crickin adapterihypoteesin kehittivät Hoagland ja Zamechnik.

Vuoteen 1958 mennessä tunnettiin seuraavat proteiinisynteesin päävaiheet: 1) aminohapon aktivointi spesifisellä entsyymillä "pH 5 -fraktiosta" ATP:n läsnä ollessa, jolloin muodostuu aminoasyyliadenylaattia; 2) aktivoidun aminohapon kiinnittäminen spesifiseen tRNA:han vapauttamalla adenosiinimonofosfaattia (AMP); 3) aminoasyyli-tRNA:n (aminohapolla ladatun tRNA:n) sitoutuminen mikrosomeihin ja aminohappojen liittäminen proteiiniin tRNA:ta vapauttaen. Hoagland (1958) totesi, että guanosiinitrifosfaattia (GTP) tarvitaan proteiinisynteesin viimeisessä vaiheessa.

RNA:iden siirto ja geenisynteesi

TRNA:iden löytämisen jälkeen aloitettiin aktiiviset haut niiden fraktioimiseksi ja nukleotidisekvenssin määrittämiseksi. Amerikkalainen biokemisti R. Holly saavutti suurimman menestyksen. Vuonna 1965 hän loi alaniinin tRNA:n rakenteen hiivasta. Käyttämällä ribonukleaaseja (guanyyli-RNaasi ja haiman RNaasi) Holly jakoi nukleiinihappomolekyylin useisiin fragmentteihin, määritti nukleotidisekvenssin kussakin niistä erikseen ja rakensi sitten uudelleen koko alaniini-tRNA-molekyylin sekvenssin. Tätä tapaa analysoida nukleotidisekvenssiä kutsutaan lohkomenetelmäksi. Hollyn ansiot koostuivat pääasiassa siitä, että hän oppi jakamaan RNA-molekyylin paitsi pieniksi paloiksi, kuten monet tekivät ennen häntä, myös suuriksi fragmenteiksi (neljännesiksi ja puolikkaiksi). Tämä antoi hänelle mahdollisuuden koota yksittäisiä pieniä paloja oikein yhteen ja siten luoda uudelleen koko tRNA-molekyylin täydellinen nukleotidisekvenssi (Nobel-palkinto, 1968).

Tämä tekniikka otettiin välittömästi käyttöön monissa laboratorioissa ympäri maailmaa. Seuraavien kahden vuoden aikana Neuvostoliitossa ja ulkomailla se salattiin ensisijainen rakenne useita tRNA:ita kerralla. A. A. Baev (1967) ja työtoverit määrittelivät nukleotidisekvenssin hiivan valiinin tRNA:ssa ensimmäistä kertaa. Tähän mennessä on tutkittu yli tusinaa erilaista yksittäistä tRNA:ta. F. Senger ja G. Brownlee tekivät Cambridgessa erikoisen ennätyksen nukleotidisekvenssin määrittämisessä. Nämä tutkijat kehittivät yllättävän tyylikkään menetelmän oligonukleotidien erottamiseksi ja niin kutsutun 5S (ribosomaalisen) RNA:n sekvensoimiseksi E. coli -soluista (1968). Tämä RNA koostuu 120 nukleotiditähteestä, ja toisin kuin tRNA, se ei sisällä muita vähäisiä emäksiä, jotka helpottavat suuresti nukleotidisekvenssin analysointia ja toimivat ainutlaatuisina maamerkeinä molekyylin yksittäisille fragmenteille. Tällä hetkellä Sangerin ja Brownleen menetelmän käytön ansiosta työtä pitkien ribosomaalisten RNA:iden ja joidenkin virus-RNA:iden sekvenssin tutkimiseksi edistetään menestyksekkäästi J. Ebelin (Ranska) ja muiden tutkijoiden laboratoriossa.

A. A. Baev ja kollegat (1967) havaitsivat, että puoliksi leikattu väliinin tRNA palauttaa makromolekyylirakenteensa liuoksessa ja primäärirakenteen puutteesta huolimatta sillä on alkuperäisen (natiivi) molekyylin toiminnallinen aktiivisuus. Tämä lähestymistapa - leikatun makromolekyylin rekonstruointi tiettyjen fragmenttien poistamisen jälkeen - osoittautui erittäin lupaavaksi. Sitä käytetään nykyään laajalti tiettyjen tRNA:iden yksittäisten osien toiminnallisen roolin selvittämiseen.

SISÄÄN viime vuodet Yksittäisten tRNA:iden kidevalmisteiden saamisessa on saavutettu suuri menestys. Monet tRNA:t on jo kiteytetty useissa laboratorioissa Yhdysvalloissa ja Englannissa. Tämä mahdollisti tRNA:n rakenteen tutkimisen röntgendiffraktioanalyysillä. Vuonna 1970 R. Bock esitteli ensimmäiset röntgenkuvat ja kolmiulotteiset mallit useista tRNA:ista, jotka hän oli luonut Wisconsinin yliopistossa. Nämä mallit auttavat määrittämään yksittäisten toiminnallisesti aktiivisten kohtien sijainnin tRNA:ssa ja ymmärtämään näiden molekyylien toiminnan perusperiaatteet.

Proteiinisynteesin mekanismin paljastamisen ja tämän prosessin spesifisyyden ongelman ratkaisemisen kannalta ensiarvoisen tärkeää oli geneettisen koodin luonteen purkaminen (katso luku 24), jota voidaan liioittelematta pitää prosessin johtavana saavutuksena. 1900-luvun luonnontieteet.

R. Hollyn löytö tRNA:n primäärirakenteesta antoi sysäyksen G. Koranan* (USA) työhön oligonukleotidien synteesin parissa ja ohjasi ne kohti spesifisen biologisen rakenteen - alaniini-tRNA:ta koodaavan DNA-molekyylin - synteesiä. Koraanin valmistamien lyhyiden oligonukleotidien kemiallisen synteesin ensimmäiset vaiheet melkein 15 vuotta sitten huipentuivat vuonna 1970 ensimmäiseen geenisynteesiin. Koraani ja hänen työtoverinsa syntetisoivat ensin kemiallisesti lyhyitä 8-12 nukleotidin fragmentteja yksittäisistä nukleotideista. Nämä tietyn nukleotidisekvenssin omaavat fragmentit muodostivat spontaanisti kaksijuosteisia komplementaarisia kappaleita, joiden päällekkäisyys oli 4–5 nukleotidia. Sitten nämä valmiit palat yhdistettiin päästä päähän oikeassa järjestyksessä DNA-ligaasin avulla. Siten toisin kuin DNA-molekyylien replikaatiossa, A. Kornbergin mukaan** (katso luku 24), Koraani onnistui luomaan uudelleen luonnollisen kaksijuosteisen DNA-molekyylin ennalta suunnitellun ohjelman mukaisesti. Hollyn kuvaama tRNA-sekvenssi. Samoin työstetään parhaillaan muiden geenien synteesiä (M. N. Kolosov, Z. A. Shabarova, D. G. Knorre, 1970 - 1975).

* (G. Koranille ja M. Nirenbergille myönnettiin Nobel-palkinto vuonna 1968 geneettisen koodin tutkimuksesta.)

** (Polymeraasin ja DNA-synteesin löytämisestä A. Kornberg ja RNA:n synteesistä S. Ochoa sai vuonna 1959 Nobel-palkinnon.)

Mikrosomit, ribosomit, translaatio

1950-luvun puolivälissä uskottiin, että mikrosomit olivat solun proteiinisynteesin keskus. A. Claude otti ensimmäisen kerran käyttöön termin mikrosomit vuonna 1949 viittaamaan pienten rakeiden fraktioon. Myöhemmin kävi ilmi, että proteiinisynteesistä ei vastaa koko mikrosomien fraktio, joka koostuu kalvoista ja rakeista, vaan vain pienistäa. R. Roberts kutsui näitä hiukkasia vuonna 1958 ribosomeiksi.

Klassisia bakteeriribosomien tutkimuksia suorittivat A. Tisier ja J. Watson vuosina 1958-1959. Bakteerien ribosomit osoittautuivat hieman pienemmiksi kuin kasvien ja eläinten ribosomit. J. Littleton (1960), M. Clark (1964) ja E. N. Svetailo (1966) osoittivat, että korkeampien kasvien ja mitokondrioiden kloroplastien ribosomit kuuluvat bakteerityyppiin. A. Tisier ja muut (1958) havaitsivat, että ribosomit hajoavat kahdeksi epätasaiseksi alayksiköksi, joista kukin sisältää yhden RNA-molekyylin. 50-luvun lopulla uskottiin, että jokainen ribosomaalinen RNA-molekyyli koostuu useista lyhyistä fragmenteista. Kuitenkin AS Spirin vuonna 1960 osoitti ensimmäisenä, että RNA:ta alipartikkeleissa edustaa jatkuva molekyyli. D. Waller (1960), joka erotti ribosomaaliset proteiinit tärkkelysgeelielektroforeesilla, havaitsi, että ne ovat hyvin heterogeenisia. Aluksi monet epäilivät Wallerin tietoja, koska näytti siltä, ​​​​että ribosomiproteiinin tulisi olla tiukasti homogeeninen, kuten esimerkiksi TMV-proteiinin. Tällä hetkellä D. Wallerin, R. Troutin, P. Traubin ja muiden biokemistien tutkimusten tuloksena on tullut tunnetuksi, että todellisten ribosomipartikkelien koostumus sisältää yli 50 rakenteeltaan täysin erilaista proteiinia. AS Spirin vuonna 1963 avasi ensimmäisenä ribosomaalisia osahiukkasia ja osoitti, että ribosomit ovat tiiviisti kierretty ribonukleoproteiinijuoste, joka voi avautua tietyissä olosuhteissa. Vuosina 1967-1968 M. Nomura rakensi täysin uudelleen biologisesti aktiivisen alayksikön ribosomaalisesta RNA:sta ja proteiinista ja sai jopa ribosomeja, joissa proteiini ja RNA kuuluivat eri mikro-organismeihin.

Ribosomaalisen RNA:n rooli on edelleen epäselvä. Oletetaan, että se on ainutlaatuinen spesifinen matriisi, jolla kukin lukuisista ribosomaalisista proteiineista löytää tiukasti määritellyn paikan ribosomaalisen partikkelin muodostumisen aikana (AS Spirin, 1968).

A. Rich (1962) löysi useiden ribosomien aggregaatteja, jotka liittyivät toisiinsa mRNA-juosteen avulla. Näitä komplekseja kutsuttiin polysomeiksi. Polysomien löytäminen antoi Richin ja Watsonin (1963) ehdottaa, että polypeptidiketjun synteesi tapahtuu ribosomissa, joka ikään kuin liikkuu mRNA-ketjua pitkin. Ribosomin liikkuessa mRNA-ketjua pitkin partikkelista luetaan tietoa ja muodostuu proteiinipolypeptidiketju, ja uudet ribosomit kiinnittyvät vuorotellen mRNA:n vapautuneeseen lukupäähän. Richin ja Watsonin tiedoista seurasi, että polysomien merkitys solussa piilee proteiinin massatuotannossa lukemalla matriisia peräkkäin useilla ribosomilla kerralla.

M. Nirenbergin, S. Ochoan, F. Lipmanin, G. Koranan ja muiden tutkimusten tuloksena vuosina 1963 - 1970. tuli tiedoksi, että mRNA:n, ribosomien, ATP:n ja aminoasyyli-tRNA:n ohella translaatioprosessiin osallistuu suuri joukko erilaisia ​​tekijöitä, ja itse translaatioprosessi voidaan jakaa ehdollisesti kolmeen vaiheeseen - aloitus, itse translaatio ja lopetus.

Käännöksen aloittaminen tarkoittaa ensimmäisen synteesiä peptidisidos kompleksissa ribosomi - matriisipolynukleotidi - aminoasyyli-tRNA. Tällaista aloitusaktiivisuutta ei ole millään aminoasyyli-tRNA:lla, vaan formyylimetionyyli-tRNA:lla. F. Senger ja K. Marker eristivät tämän aineen ensimmäisen kerran vuonna 1964. S. Bretcher ja K. Marker (1966) osoittivat, että formyylimetionyyli-tRNA:n aloitustoiminto johtuu sen lisääntyneestä affiniteetista ribosomin peptidyylikeskukseen. Translaation alkaessa äärimmäisen tärkeitä ovat myös jotkut proteiinin aloitustekijät, jotka eristettiin S. Ochoan, F. Gron ja muiden tutkimuskeskusten laboratorioissa. Ensimmäisen peptidisidoksen muodostumisen jälkeen ribosomissa alkaa itse translaatio, ts. aminoasyylitähteen peräkkäinen lisäys polypeptidin C-päähän. K. Monroe ja J. Bishop (Englanti), I. Rykhlik ja F. Shorm (Tsekkoslovakia), F. Lipman, M. Bretcher, W. Gilbert (USA) ja muut tutkijat tutkivat monia käännösprosessin yksityiskohtia. Vuonna 1968 A. S. Spirin ehdotti alkuperäisen hypoteesin selittääkseen ribosomin mekanismin. Ohjausmekanismi, joka varmistaa kaikki tRNA:n ja mRNA:n spatiaaliset liikkeet translaation aikana, on ribosomialahiukkasten säännöllinen avautuminen ja sulkeminen. Translaatiopääte on koodattu itse luettavaan matriisiin, joka sisältää lopetuskodonit. Kuten S. Brenner (1965 - 1967) on osoittanut, tripletit UAA, UAG ja UGA ovat sellaisia ​​kodoneja. M. Capecci (1967) tunnisti myös erityisiä proteiinin lopetustekijöitä. AS Spirin ja LP Gavrilova kuvasivat niin sanotun "ei-entsymaattisen" proteiinisynteesin ribosomeissa (1972 - 1975) ilman proteiinitekijöiden osallistumista. Tämä löytö on tärkeä proteiinibiosynteesin alkuperän ja kehityksen ymmärtämiseksi.

Geeni- ja proteiinitoiminnan säätely

Proteiinisynteesin spesifisyyden ongelman jälkeen proteiinisynteesin säätelyn ongelma, tai mikä on sama, geenitoiminnan säätely, osoittautui molekyylibiologian ensimmäiseksi.

Solujen toiminnallinen epäekvivalenssi ja siihen liittyvä geenien tukahduttaminen ja aktivoituminen ovat jo pitkään herättäneet geneetikkojen huomion, mutta viime aikoihin asti todellinen geenitoiminnan säätelymekanismi jäi tuntemattomaksi.

Ensimmäiset yritykset selittää geenien säätelyaktiivisuutta liittyivät histoniproteiinien tutkimukseen. Jopa Steadmanin puolisot * XX vuosisadan 40-luvun alussa. ehdotti, että juuri histoneilla voi olla päärooli tässä ilmiössä. Myöhemmin he saivat ensimmäiset selkeät tiedot histoniproteiinien kemiallisen luonteen eroista. Tällä hetkellä tämän hypoteesin puolesta todistavien tosiseikkojen määrä kasvaa joka vuosi.

* (E. Stedman, E. Stedman. Soluytimien perusproteiinit. - Filosofi. Trans. Roy. soc. Lontoo, 1951, v. 235, 565 - 595.)

Samalla kaikki kertyy lisää tiedot, jotka viittaavat siihen, että geeniaktiivisuuden säätely on paljon monimutkaisempi prosessi kuin yksinkertainen geeniosien vuorovaikutus histoniproteiinimolekyylien kanssa. Vuosina 1960-1962 R. B. Khesin-Lurien laboratoriossa havaittiin, että faagigeenit alkavat lukea epäsuhtaisesti: T2-faagin geenit voidaan jakaa varhaisiin geeneihin, joiden toiminta tapahtui tartunnan ensimmäisinä minuuteina bakteerisolu, ja myöhemmät, jotka alkoivat syntetisoida mRNA:ta varhaisten geenien työn päätyttyä.

Vuonna 1961 ranskalaiset biokemistit F. Jacob ja J. Monod ehdottivat geeniaktiivisuuden säätelyjärjestelmää, jolla oli poikkeuksellinen rooli solun säätelymekanismien ymmärtämisessä yleisesti. Jacobin ja Monodin kaavion mukaan DNA sisältää rakenteellisten (informaatio)geenien lisäksi myös geenejä säätelijöitä ja geenejä operaattoreita. Säätelijägeeni koodaa tietyn aineen - repressorin - synteesiä, joka voi kiinnittyä sekä indusoija- että operaattorigeeniin. Operaattorigeeni on kytketty rakennegeeneihin, kun taas säätelijägeeni sijaitsee jonkin matkan päässä niistä. Jos ympäristössä ei ole induktoria, esimerkiksi laktoosia, niin säätelijägeenin syntetisoima repressori sitoutuu operaattorigeeniin ja estäen sen sammuttaa koko operonin (rakenteellisten geenien lohko yhdessä operaattorin kanssa). joka hallitsee niitä). Entsyymin muodostumista ei tapahdu näissä olosuhteissa. Jos elatusaineessa esiintyy induktori (laktoosi), säätelijägeenin tuote, repressori, sitoutuu laktoosiin ja poistaa lohkon operaattorigeenistä. Tällöin entsyymin synteesiä koodaavan rakennegeenin työ tulee mahdolliseksi ja entsyymi (laktoosi) ilmestyy väliaineeseen.

Jacobin ja Monodin mukaan tätä säätöjärjestelmää voidaan soveltaa kaikkiin adaptiivisiin entsyymeihin ja se voi tapahtua sekä repression aikana, kun entsyymin muodostumista estää reaktiotuotteen ylimäärä, että induktion aikana, kun substraatin lisääminen aiheuttaa entsyymin synteesi. Geenitoiminnan säätelyn tutkimuksista Jacob ja Monod saivat Nobel-palkinnon vuonna 1965.

Aluksi tämä suunnitelma vaikutti liian kaukaa haetulta. Myöhemmin kuitenkin kävi ilmi, että geenien säätely tämän periaatteen mukaisesti ei tapahdu vain bakteereissa, vaan myös muissa organismeissa.

Vuodesta 1960 lähtien merkittävä paikka molekyylibiologiassa on ollut tutkimuksilla genomin organisoinnista ja kromatiinin rakenteesta eukaryoottisissa organismeissa (J. Bonner, R. Britten, W. Olfrey, P. Walker, Yu. S. Chentsov , I. B. Zbarsky ja muut .) ja transkription säätely (A. Mirsky, G. P. Georgiev, M. Bernstiel, D. Goll, R. Tsanev, R. I. Salganik). Repressorin luonne pysyi pitkään tuntemattomana ja kiistanalaisena. Vuonna 1968 M. Ptashne (USA) osoitti, että proteiini on repressori. Hän eristi sen J. Watsonin laboratoriossa ja havaitsi, että repressorilla todellakin on affiniteettia induktoriin (laktoosiin) ja samalla "tunnistaa" lac-operonin operaattorigeenin ja sitoutuu siihen spesifisesti.

Viimeisten 5-7 vuoden aikana on saatu tietoa toisen geeniaktiivisuuden kontrollisolun - promoottorin - läsnäolosta. Kävi ilmi, että operaattoripaikan vieressä, johon säätelijägeenillä syntetisoitu tuote on kiinnitetty - proteiiniaine repressori, on toinen kohta, joka pitäisi myös katsoa geenitoiminnan säätelyjärjestelmän jäseniksi. Liitteenä tähän osioon proteiinimolekyyli RNA-polymeraasientsyymi. Promoottorialueella täytyy tapahtua DNA:n ainutlaatuisen nukleotidisekvenssin ja RNA-polymeraasiproteiinin spesifisen konfiguraation vastavuoroinen tunnistaminen. Geneettisen informaation lukuprosessin toteuttaminen tietyllä promoottorin vieressä olevan operonin geenisekvenssillä riippuu tunnistustehokkuudesta.

Jacobin ja Monodin kuvaaman järjestelmän lisäksi solussa on muitakin geenisäätelymekanismeja. F. Jacob ja S. Brenner (1963) totesivat, että bakteerien DNA:n replikaation säätelyä säätelee tietyllä tavalla solukalvo. Jacobin (1954) kokeet erilaisten profaagien induktiosta osoittivat vakuuttavasti, että lysogeenisten bakteerien solussa olevien erilaisten mutageenisten tekijöiden vaikutuksesta profaagigeenin selektiivinen replikaatio alkaa ja isäntägenomin replikaatio estyy. Vuonna 1970 F. Bell raportoi, että pienet DNA-molekyylit voivat siirtyä ytimestä sytoplasmaan ja transkriptoitua siellä.

Siten geeniaktiivisuutta voidaan säädellä replikaation, transkription ja translaation tasolla.

Entsyymien synteesin, mutta myös niiden toiminnan säätelyn tutkimisessa on edistytty merkittävästi. A. Novik ja L. Szilard huomauttivat entsyymien toiminnan säätelyn ilmiöistä solussa jo 1950-luvulla. G. Umbarger (1956) havaitsi, että solussa on hyvin rationaalinen tapa tukahduttaa entsyymin aktiivisuus lopputuote palautereaktioketjut. Kuten J. Monod, J. Change, F. Jacob, A. Purdy ja muut tutkijat (1956 - 1960) ovat todenneet, entsyymiaktiivisuuden säätely voidaan suorittaa allosteerisen periaatteen mukaisesti. Entsyymillä tai jollakin sen alayksiköistä on substraatin affiniteetin lisäksi affiniteetti johonkin reaktioketjun tuotteeseen. Tällaisen signaalituotteen vaikutuksesta entsyymi muuttaa konformaatiotaan siten, että se menettää aktiivisuuden. Tämän seurauksena koko entsymaattisten reaktioiden ketju kytkeytyy pois päältä heti alussa. D. Wieman ja R. Woodward (1952; Nobel-palkinnon voittaja, 1965) korostivat proteiinin konformaatiomuutosten olennaista roolia entsymaattisissa reaktioissa ja tietyssä mielessä allosteerisen vaikutuksen olemassaoloa.

Proteiinien rakenne ja toiminta

T. Osbornen, G. Hofmeisterin, A. Gurberin, F. Schulzin ja monien muiden työn tuloksena myöhään XIX V. Monet eläin- ja kasviproteiinit on saatu kiteisessä muodossa. Samoihin aikoihin tiettyjen proteiinien molekyylipainot määritettiin erilaisilla fysikaalisilla menetelmillä. Joten vuonna 1891 A. Sabaneev ja N. Aleksandrov raportoivat, että ovalbumiinin molekyylipaino on 14 000; Vuonna 1905 E. Reid havaitsi, että hemoglobiinin molekyylipaino on 48 000. Proteiinien polymeerisen rakenteen löysivät vuonna 1871 G. Glasivetz ja D. Gaberman. Ajatuksen yksittäisten aminohappotähteiden peptidisidoksesta proteiineissa esitti T. Curtius (1883). Työ aminohappojen kemiallisesta kondensaatiosta (E. Schaal, 1871; G. Schiff, 1897; L. Balbiano ja D. Traschiatti, 1900) ja heteropolypeptidien synteesistä (E. Fisher, 1902 - 1907, Nobel-palkinto, 1902) johti perusperiaatteiden kehittämiseen kemiallinen rakenne proteiinit.

Ensimmäisen kiteisen entsyymin (ureaasin) hankki vuonna 1926 J. Sumner (Nobel-palkinto, 1946), ja vuonna 1930 J. Northrop (Nobel-palkinto, 1946) sai kiteistä pepsiiniä. Näiden töiden jälkeen kävi selväksi, että entsyymit ovat luonteeltaan proteiinia. Vuonna 1940 M. Kunits eristi kiteisen RNaasin. Vuoteen 1958 mennessä tunnettiin jo yli 100 kiteistä entsyymiä ja yli 500 ei-kiteistä entsyymiä. Yksittäisten proteiinien erittäin puhtaiden valmisteiden saaminen auttoi niiden primäärirakenteen ja makromolekyyliorganisaation purkamiseen.

Suuri merkitys molekyylibiologian yleisen kehityksen ja erityisesti ihmisen genetiikan kehitykselle oli L. Paulingin (1940) löytö epänormaalista hemoglobiini S:stä, joka oli eristetty sellaisten ihmisten punasoluista, joilla on vakava perinnöllinen sairaus, sirppisoluanemia. Vuosina 1955-1957 W. Ingram käytti F. Sangerin kehittämää "sormenjälki"-menetelmää (yksittäisten peptidien muodostamia täpliä paperin kromatografian aikana) hemoglobiini S:n hydrolyysituotteiden analysoimiseksi alkalilla ja trypsiinillä. Vuonna 1961 Ingram raportoi, että hemoglobiini S eroaa normaalista hemoglobiinista vain yhden aminohappotähteen luonteen suhteen: normaalissa hemoglobiinissa glutamiinihappotähde on ketjun seitsemännessä asemassa ja hemoglobiini S:ssä valiinitähde. Näin ollen Paulingin (1949) oletus, että sirppisoluanemia on molekyyliluonne, vahvistettiin täysin. Perinnöllinen muutos vain yhdessä aminohappotähteessä hemoglobiinin makromolekyylin kummassakin puolikkaassa johtaa siihen, että hemoglobiini menettää helposti liukenemiskykynsä alhaisella happipitoisuudella ja alkaa kiteytyä, mikä johtaa solurakenteen häiriintymiseen. Nämä tutkimukset osoittivat selvästi, että proteiinin rakenne on tiukasti määritelty aminohapposekvenssi, joka on koodattu genomiin. K. Anfinsenin (1951) teokset todistivat proteiinin primäärirakenteen poikkeuksellisesta merkityksestä makromolekyylin ainutlaatuisen biologisesti aktiivisen konformaation muodostumisessa. Anfinsen osoitti, että haiman ribonukleaasin biologisesti aktiivinen makrorakenne, joka menetetään palautumisen seurauksena, on ennalta määrätty aminohapposekvenssin mukaan ja se voi ilmaantua uudelleen spontaanisti kysteiinitähteiden SH-ryhmien hapettumisen aikana, jolloin muodostuu tiukasti disulfidisilloituksia. määritellyt paikat entsyymin peptidiketjussa.

Toistaiseksi vaikutusmekanismia on tutkittu yksityiskohtaisesti. suuri numero entsyymit ja monien proteiinien rakenne on määritetty.

Vuonna 1953 F. Sanger loi insuliinin aminohapposekvenssin. : Tämä proteiini koostuu kahdesta polypeptidiketjusta, jotka on yhdistetty kahdella disulfidiristisidoksella. Toinen ketjuista sisältää vain 21 aminohappotähdettä, kun taas toinen sisältää 30 tähdettä. Sanger käytti noin 10 vuotta tämän suhteellisen yksinkertaisen proteiinin rakenteen tulkitsemiseen. Vuonna 1958 hänelle myönnettiin Nobel-palkinto tästä erinomaisesta tutkimuksesta. Sen jälkeen kun V. Stein ja S. Moore (1957) loivat automaattisen aminohappoanalysaattorin, proteiinien osittaisen hydrolyysin tuotteiden tunnistaminen nopeutui merkittävästi. Vuonna 1960 Stein ja Moore raportoivat siitä jo. että he pystyivät määrittämään ribonukleaasin sekvenssin, jonka peptidiketjua edustaa 124 aminohappotähdettä. Samana vuonna G. Schrammin laboratoriossa Tübingenissä (Saksa) F. Anderer ja muut määrittelivät aminohapposekvenssin TMV-proteiinissa. Sitten määritettiin aminohapposekvenssi myoglobiinista (A. Edmunson) ja ihmisen hemoglobiinin α- ja β-ketjuista (G. Braunitzer, E. Schroeder jne.), lysotsyymistä munaproteiinista (J. Jollet, D. Keyfield) . Vuonna 1963 F. Shorm ja B. Keil (Tšekoslovakia) perustivat aminohapposekvenssin kymotrypsinogeenimolekyyliin. Samana vuonna määritettiin trypsinogeenin aminohapposekvenssi (F. Shorm, D. Walsh). Vuonna 1965 K. Takahashi loi ribonukleaasi T1:n primäärirakenteen. Sitten määritettiin aminohapposekvenssi useille muille proteiineille.

Kuten tiedetään, lopullinen todiste tietyn rakenteen määritelmän oikeellisuudesta on sen synteesi. Vuonna 1969 R. Merifield (USA) suoritti ensimmäisenä haiman ribonukleaasin kemiallisen synteesin. Käyttämällä synteesimenetelmää, jonka hän kehitti kiinteän faasin kantajalle, Merifield lisäsi ketjuun aminohapon toisensa jälkeen Steinin ja Mooren kuvaaman sekvenssin mukaisesti. Tämän seurauksena hän sai proteiinin, joka oli ominaisuuksiltaan identtinen haiman ribonukleaasi A:n kanssa. Ribonukleaasin rakenteen löytämisestä V. Stein, S. Moore ja K. Anfinsen saivat Nobel-palkinnon vuonna 1972. Tämä luonnollinen proteiinisynteesi avaa valtavia näkymiä, mikä viittaa mahdollisuuteen luoda mitä tahansa proteiineja ennalta suunnitellun sekvenssin mukaisesti.

W. Astburyn (1933) röntgentutkimuksista seurasi, että proteiinimolekyylien peptidiketjut ovat kierretty tai pinottu jollain tiukasti määritellyllä tavalla. Siitä lähtien monet kirjoittajat ovat esittäneet erilaisia ​​hypoteeseja tavoista, joilla proteiiniketjut laskostuvat, mutta vuoteen 1951 asti kaikki mallit pysyivät spekulatiivisina rakenteina, jotka eivät vastanneet kokeellisia tietoja. Vuonna 1951 L. Pauling ja R. Corey julkaisivat sarjan loistavia teoksia, joissa proteiinien sekundaarirakenteen teoria, α-heliksin teoria, lopulta muotoiltiin. Samalla tuli myös tiedoksi, että proteiineilla on myös tertiäärinen rakenne: peptidiketjun α-heliksi voidaan laskostaa tietyllä tavalla, jolloin muodostuu melko kompakti rakenne.

Vuonna 1957 J. Kendrew ja hänen työtoverinsa ehdottivat ensimmäisen kerran kolmiulotteista mallia myoglobiinin rakenteesta. Tätä mallia jalostettiin sitten useiden vuosien ajan, kunnes se ilmestyi vuonna 1961 lopullinen työ jolla on tämän proteiinin tilarakenteen ominaisuus. Vuonna 1959 M. Perutz ja kollegat loivat hemoglobiinin kolmiulotteisen rakenteen. Tutkijat käyttivät tähän työhön yli 20 vuotta (Perutz sai ensimmäiset hemoglobiinin röntgenkuvat vuonna 1937). Koska hemoglobiinimolekyyli koostuu neljästä alayksiköstä, sen organisoitumisen jälkeen Perutz kuvasi ensin proteiinin kvaternaarisen rakenteen. Proteiinien kolmiulotteisen rakenteen määrittämisestä tehdystä työstä Kendrew ja Perutz saivat Nobel-palkinnon vuonna 1962.

Perutzin tekemä tilamalli hemoglobiinin rakenteesta SALLITTU. päästä lähemmäksi tämän proteiinin toimintamekanismin ymmärtämistä. Proteiini, kuten tiedetään, kuljettaa happea eläinsoluissa. Vuonna 1937 F. Gaurowitz tuli siihen tulokseen, että hemoglobiinin vuorovaikutukseen hapen, ilman kanssa pitäisi liittyä proteiinin rakenteen muutos. 1960-luvulla Perutz ja työtoverit havaitsivat huomattavan muutoksen hemoglobiiniketjuissa sen hapettumisen jälkeen, mikä johtui rautaatomien siirtymisestä hapen kanssa sitoutumisen seurauksena. Tämän perusteella muodostettiin ajatuksia proteiinimakromolekyylien "hengityksestä".

Vuonna 1960 D. Phillips ja hänen työtoverinsa aloittivat lysotsyymimolekyylin röntgendiffraktiotutkimukset. Vuoteen 1967 mennessä he pystyivät enemmän tai vähemmän selvittämään tämän proteiinin organisaation yksityiskohdat ja yksittäisten atomien sijainnin sen molekyylissä. Lisäksi Phillips selvitti lysotsyymin lisäämisen luonteen substraattiin (triasetyyliglukosamiini). Tämä mahdollisti tämän entsyymin mekanismin uudelleenluomisen. Siten primäärirakenteen ja makromolekyyliorganisaation tuntemus mahdollisti paitsi monien entsyymien aktiivisten keskusten luonteen määrittämisen, myös näiden makromolekyylien toimintamekanismin täydellisen paljastamisen.

Elektronimikroskopiamenetelmien käyttö auttoi paljastamaan monimutkaisten proteiinimuodostelmien, kuten kollageenin, fibrinogeenin, supistuvien lihasfibrillien jne. makromolekyyliorganisaation periaatteet. 1950-luvun lopulla esitettiin malleja lihasten supistumislaitteistosta. Poikkeuksellisen tärkeä lihasten supistumisen mekanismin ymmärtämisen kannalta oli V. A. Engelgardtin ja M. N. Lyubimovan (1939) löytö myosiinin ATPaasiaktiivisuudesta. Tämä tarkoitti, että lihasten supistuminen perustuu supistuvan proteiinin fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien ja makromolekyyliorganisaation muutokseen adenosiinitrifosforihapon vaikutuksesta (katso myös luku 11).

Virologinen tutkimus on ollut olennaista biologisten rakenteiden kokoamisen periaatteiden ymmärtämisessä (ks. luku 25).

Ratkaisemattomat ongelmat

Tärkeimmät edistysaskeleet modernissa molekyylibiologiassa on saavutettu pääasiassa nukleiinihappojen tutkimuksen tuloksena. Kaikkea ongelmaa ei kuitenkaan ole ratkaistu tälläkään alueella. Suuria ponnisteluja tarvitaan erityisesti genomin koko nukleotidisekvenssin purkamiseen. Tämä ongelma puolestaan ​​liittyy erottamattomasti DNA:n heterogeenisyyteen ja vaatii uusien edistyneiden menetelmien kehittämistä yksittäisten molekyylien fraktiointiin ja eristämiseen solun geneettisestä kokonaismateriaalista.

Tähän asti ponnistelut ovat keskittyneet pääasiassa proteiinien ja nukleiinihappojen erilliseen tutkimukseen. Solussa nämä biopolymeerit liittyvät erottamattomasti toisiinsa ja toimivat pääasiassa nukleoproteiinien muodossa. Siksi tarve tutkia proteiinien ja nukleiinihappojen vuorovaikutusta on nyt tullut erityisen akuutiksi. Proteiinien tiettyjen nukleiinihappoosien tunnistamisen ongelma tuodaan esiin. Näiden biopolymeerien tällaisen vuorovaikutuksen tutkimiseksi on jo hahmoteltu vaiheita, joita ilman kromosomien, ribosomien ja muiden rakenteiden rakenteen ja toimintojen täydellinen ymmärtäminen on mahdotonta ajatella. Ilman tätä on myös mahdotonta ymmärtää geenitoiminnan säätelyä ja lopulta tulkita ptoiminnan periaatteita. Jacobin ja Monodin työn jälkeen ilmestyi uutta tietoa kalvojen säätelymerkityksestä ydinmateriaalin synteesissä. Tämä aiheuttaa ongelman syvemmälle tutkimukselle kalvojen roolista DNA:n replikaation säätelyssä. Yleisesti ottaen geenitoiminnan ja solujen aktiivisuuden säätelyongelmasta on tullut yksi modernin molekyylibiologian tärkeimmistä ongelmista.

Biofysiikan nykytila

Biofysiikan kehitys eteni läheisessä yhteydessä molekyylibiologian ongelmien kanssa. Kiinnostusta tätä biologian aluetta kohtaan vauhditti toisaalta tarve tutkia kattavasti erilaisten säteilyn vaikutusta kehoon ja toisaalta tarve tutkia fysikaalisia ja molekyylitasolla tapahtuvien elämänilmiöiden fysikaalis-kemialliset perusteet.

Tarkan tiedon saaminen molekyylirakenteista ja niissä tapahtuvista prosesseista tuli mahdolliseksi uusien hienojen fysikaalisten ja kemiallisten menetelmien käytön seurauksena. Sähkökemian saavutusten perusteella oli mahdollista parantaa biosähköisten potentiaalien mittausmenetelmää käyttämällä ioniselektiivisiä elektrodeja (G. Eisenman, B.P. Nikolsky, Khuri, 50-60s). Infrapunaspektroskopia (laserlaitteita käyttämällä) on tulossa yhä enemmän käytäntöön, mikä mahdollistaa proteiinien konformaatiomuutosten tutkimisen (I. Plotnikov, 1940). Arvokasta tietoa tarjoavat myös elektronien paramagneettisen resonanssin menetelmä (E. K. Zavoisky, 1944) ja biokemiluminesenssimenetelmä (B. N. Tarusov et al., 1960), joiden avulla voidaan erityisesti arvioida elektronien kulkeutumista oksidatiivisten prosessien aikana.

1950-luvulla biofysiikka oli jo saamassa vahvaa asemaa. On tarpeen kouluttaa päteviä asiantuntijoita. Jos vuonna 1911 Euroopassa vain Pécsin yliopistossa Unkarissa oli biofysiikan oppituoli, niin vuoteen 1973 mennessä tällaisia ​​​​tuoleja on olemassa melkein kaikissa suurimmissa yliopistoissa.

Vuonna 1960 perustettiin International Society of Biophysicists. Elokuussa 1961 Tukholmassa pidettiin ensimmäinen kansainvälinen biofysiikan kongressi. Toinen kongressi pidettiin vuonna 1965 Pariisissa, kolmas - vuonna 1969 Bostonissa, neljäs - vuonna 1972 Moskovassa.

Biofysiikassa erotetaan selkeästi kaksi erisisältöistä aluetta - molekyylibiofysiikka ja solubiofysiikka. Tämä ero saa myös organisatorisen ilmaisun: näille kahdelle biofysiikan alueelle ollaan luomassa erillisiä osastoja. Moskovan yliopistossa ensimmäinen biofysiikan laitos perustettiin vuonna 1953 biologian ja maaperätieteen tiedekuntaan, ja vähän myöhemmin biofysiikan laitos ilmestyi fysiikan tiedekuntaan. Samalla periaatteella järjestettiin laitokset monissa muissa yliopistoissa.

Molekyylibiofysiikka

Viime vuosina molekyylibiofysiikan ja molekyylibiologian välinen yhteys on vahvistunut yhä enemmän, ja nyt on toisinaan vaikea määrittää, missä niiden välinen raja kulkee. Yleisessä hyökkäyksessä perinnöllisen tiedon ongelmaa vastaan ​​tällainen yhteistyö biofysiikan ja molekyylibiologian välillä on väistämätöntä.

Pääsuunta sisään tutkimustyö on tutkimus nukleiinihappojen - DNA:n ja RNA:n - fysiikasta. Yllä olevien menetelmien käyttö ja ennen kaikkea röntgendiffraktioanalyysi auttoivat nukleiinihappojen molekyylirakenteen purkamiseen. Tällä hetkellä on meneillään intensiivinen tutkimus näiden happojen käyttäytymisen tutkimiseksi liuoksissa. Erityistä huomiota kiinnitetään "helix-coil" -konformaatiosiirtymiin, joita tutkitaan viskositeetin, optisten ja sähköisten parametrien muutoksilla. Mutageneesin mekanismien tutkimuksen yhteydessä kehitetään tutkimuksia, joissa tutkitaan ionisoivan säteilyn vaikutusta nukleiinihappojen käyttäytymiseen liuoksissa sekä säteilyn vaikutusta virusten ja faagien nukleiinihappoihin. Ultraviolettisäteilyn vaikutus, jonka joidenkin spektrialueiden tiedetään absorboituvan hyvin nukleiinihapoihin, analysoitiin kattavasti. Iso tietty painovoima tällaisessa tutkimuksessa on nukleiinihappojen ja proteiinien aktiivisten radikaalien havaitseminen elektroniparamagneettisen resonanssin menetelmällä. Tämän menetelmän käyttöön liittyy kokonaisen itsenäisen suunnan syntyminen.

Ongelma DNA- ja RNA-informaation koodaamisesta ja sen välittämisestä proteiinisynteesin aikana on pitkään kiinnostanut molekyylibiofysiikkaa, ja fyysikot ovat toistuvasti esittäneet tiettyjä näkökohtia tästä aiheesta (E. Schrödinger, G. Gamow). Geneettisen koodin purkaminen aiheutti lukuisia teoreettisia ja kokeellisia tutkimuksia DNA-kierteen rakenteesta, sen säikeiden liuku- ja kiertymismekanismista. fyysinen voima mukana näissä prosesseissa.

Molekyylibiofysiikka tarjoaa huomattavaa apua molekyylibiologialle proteiinimolekyylien rakenteen tutkimisessa röntgendiffraktioanalyysin avulla, jota J. Bernal käytti ensimmäisen kerran vuonna 1930. Fysikaalisten menetelmien ja biokemiallisten (entsymaattisten menetelmien) käytön seurauksena useiden proteiinien molekyylikonformaatio ja aminohapposekvenssi paljastettiin.

Nykyaikaiset elektronimikroskooppiset tutkimukset, jotka paljastivat monimutkaisten kalvojärjestelmien läsnäolon soluissa ja niiden organelleissa, stimuloivat yrityksiä ymmärtää niiden molekyylirakennetta (katso luvut 10 ja 11). Tutkittu in vivo kemiallinen koostumus kalvot ja erityisesti niiden lipidien ominaisuudet. Havaittiin, että viimeksi mainitut kykenevät ylihapettumaan ja ketjuhapetuksen ei-entsymaattisiin reaktioihin (Yu. A. Vladimirov ja F. F. Litvin, 1959; B. N. Tarusov et ai., 1960; I. I. Ivanov, 1967), mikä johtaa kalvon toimintahäiriöön. Kalvojen koostumuksen tutkimiseen alettiin käyttää myös matemaattisen mallintamisen menetelmiä (V. Ts. Presman, 1964 - 1968; M. M. Shemyakin, 1967; Yu. A. Ovchinnikov, 1972).

Solujen biofysiikka

Merkittävä tapahtuma biofysiikan historiassa oli selkeiden käsitysten muodostuminen termodynamiikasta 50-luvulla biologisia prosesseja, minkä seurauksena olettamukset mahdollisuudesta itsenäisesti tuottaa energiaa elävissä soluissa, vastoin termodynamiikan toista pääsääntöä, lopulta katosivat. Tämän lain toiminnan ymmärtäminen biologisissa järjestelmissä liittyy belgialaisen tiedemiehen I. Prigozhinin (1945) * esittelyyn käsitteen biologiseen termodynamiikkaan. avoimet järjestelmät jotka vaihtavat energiaa ja ainetta ympäristön kanssa. Prigogine osoitti, että eläviin soluihin muodostuu positiivista entropiaa työprosessien aikana termodynamiikan toisen lain mukaisesti. Hänen esittämänsä yhtälöt määrittelivät olosuhteet, joissa niin sanottu stationäärinen tila syntyy (aiemmin sitä kutsuttiin myös dynaamiseksi tasapainoksi), joissa määrä ilmaista energiaa(negentropia), joka tulee soluihin ruoan kanssa, kompensoi sen kulutuksen ja positiivinen entropia erittyy. Tämä löytö vahvisti yleistä biologista käsitystä solujen ulkoisen ja sisäisen ympäristön välisestä erottamattomasta yhteydestä. Se merkitsi alkua todelliselle tutkimukselle elävien järjestelmien termodynamiikasta, mukaan lukien mallinnusmenetelmä (A. Burton, 1939; A. G. Pasynsky, 1967).

* (yleinen teoria avoimet järjestelmät esitti ensimmäisen kerran L. Bertalanffy vuonna 1932.)

Biotermodynamiikan perusperiaatteen mukaan välttämätön edellytys Elämän olemassaolo osoittautuu kiinteäksi sen biokemiallisten prosessien kehityksessä, jonka toteuttamiseksi tarvitaan lukuisten metabolisten reaktioiden nopeuksien koordinointia. Uuden biofysikaalisen termodynamiikan pohjalta on syntynyt suuntaus, joka erottaa ulkoiset ja sisäiset tekijät, jotka varmistavat tämän reaktioiden koordinaation ja tekevät siitä vakaan. Viimeisten kahden vuosikymmenen aikana on paljastunut suuri rooli inhibiittoreiden ja erityisesti antioksidanttien järjestelmän paikallaan pitämisessä (B. N. Tarusov ja A. I. Zhuravlev, 1954, 1958). On todettu, että kiinteän kehityksen luotettavuus liittyy ympäristötekijöihin (lämpötila) ja soluympäristön fysikaalis-kemiallisiin ominaisuuksiin.

Nykyaikaiset biotermodynamiikan periaatteet ovat mahdollistaneet fysikaalis-kemiallisen tulkinnan sopeutumismekanismista. Tietojemme mukaan sopeutuminen ympäristöolosuhteisiin voi tapahtua vain, jos niiden muuttuessa organismi pystyy vakiinnuttamaan biokehityksen paikallaan. kemialliset reaktiot(B. N. Tarusov, 1974). Heräsi kysymys uusien menetelmien kehittämisestä, jotka mahdollistaisivat stationaaritilan arvioinnin in vivo ja sen mahdollisten rikkomusten ennustamisen. Itsesäätelyjärjestelmien kyberneettisten periaatteiden tuominen biotermodynamiikkaan ja biologisen sopeutumisprosessin tutkimukseen lupaa suurta hyötyä. Kävi selväksi, että vakaan tilan stabiilisuusongelman ratkaisemiseksi on tärkeää ottaa huomioon ns. häiritsevät tekijät, joihin kuuluvat erityisesti lipidien hapettumisen ei-entsymaattiset reaktiot. SISÄÄN Viime aikoina tutkimus elävien solujen lipidifaasien ylihapetusprosesseista ja kalvojen säätelytoimintoja häiritsevien aktiivisten radikaalituotteiden kasvusta laajenee yhä enemmän. Tietolähde näistä prosesseista on sekä aktiivisten peroksidiradikaalien että biolipidiperoksidiyhdisteiden havaitseminen (A. Tappel, 1965; I. I. Ivanov, 1965; E. B. Burlakova, 1967 ja muut). Radikaalien havaitsemiseen käytetään biokemiluminesenssia, jota esiintyy elävien solujen lipideissä niiden rekombinaation aikana.

Vakaan tilan stabiilisuutta koskevien fysikaalis-kemiallisten käsitysten perusteella syntyi biofysikaalisia ideoita kasvien sopeutumisesta ympäristöolosuhteiden muutoksiin estävän antioksidanttijärjestelmän rikkomisena (B. N. Tarusov, Ya. E. Doskoch, B. M. Kitlaev, A. M. Agaverdiev, 1968 - 1972). Tämä avasi mahdollisuuden arvioida sellaisia ​​ominaisuuksia kuin pakkaskestävyys ja suolakestävyys sekä tehdä asianmukaisia ​​ennusteita viljelykasvien valinnassa.

1950-luvulla löydettiin erittäin heikko hehku - useiden biologisten esineiden biokemiluminesenssi spektrin näkyvässä ja infrapunaosassa (B. N. Tarusov, A. I. Zhuravlev, A. I. Polivoda). Tämä tuli mahdolliseksi, kun kehitettiin menetelmiä superheikkojen valovirtojen rekisteröimiseksi valomonistimien avulla (L. A. Kubetsky, 1934). Koska biokemiluminesenssi on seurausta elävässä solussa tapahtuvista biokemiallisista reaktioista, se mahdollistaa tärkeiden oksidatiivisten prosessien arvioinnin entsyymien välisissä elektroninsiirtoketjuissa. Biokemiluminesenssin löytämisellä ja tutkimuksella on suuri teoreettinen ja käytännön merkitys. Siten B. N. Tarusov ja Yu. ionisoiva säteily, karsinogeneesin ja muiden häiriöiden kanssa normaalit toiminnot soluja.

1950-luvulla ydinfysiikan nopean kehityksen yhteydessä radiobiologia nousi biofysiikasta. biologista toimintaa ionisoiva säteily. Keinotekoisten radioaktiivisten isotooppien hankkiminen, lämpöydinaseiden luominen, ydinreaktorit ja muiden atomienergian käytännön käyttötapojen kehittyminen on akuuttisti asettanut ongelman suojella organismeja haitallinen vaikutus ionisoiva säteily, kehitys teoreettiset perusteet säteilysairauden ehkäisy ja hoito. Tätä varten oli ensinnäkin selvitettävä, mitkä solun komponentit ja aineenvaihduntalinkit ovat haavoittuvimpia.

Biofysiikan ja radiobiologian tutkimuksen kohteena oli elävissä substraateissa säteilyenergian vaikutuksesta tapahtuvien primääristen kemiallisten reaktioiden luonteen selvittäminen. Täällä ei ollut tärkeää vain ymmärtää tämän ilmiön mekanismeja, vaan myös pystyä vaikuttamaan fyysisen energian vaihtamisprosessiin kemialliseen energiaan, pienentämään sen "hyödyllisen" toiminnan kerrointa. Tämänsuuntaisen työn aloittivat opinnot N. N. Semenovin (1933) koulussa Neuvostoliitossa ja D. Hinshelwoodin (1935) koulussa Englannissa.

Radiobiologisessa tutkimuksessa tärkeä paikka oli eri organismien säteilynkestävyysasteen tutkimuksella. Havaittiin, että lisääntynyt radioresistenssi (esimerkiksi aavikon jyrsijöillä) johtuu solukalvon lipidien korkeasta antioksidanttiaktiivisuudesta (M. Chang et ai., 1964; N. K. Ogryzov et ai., 1969). Kävi ilmi, että tokoferoleilla, K-vitamiinilla ja tioyhdisteillä on tärkeä rooli näiden järjestelmien antioksidanttisten ominaisuuksien muodostumisessa (II Ivanov et al., 1972). Myös mutageneesimekanismien tutkimukset ovat viime vuosina herättäneet paljon huomiota. Tätä tarkoitusta varten tutkitaan ionisoivan säteilyn vaikutusta nukleiinihappojen ja proteiinien käyttäytymiseen in vitro sekä viruksissa ja faageissa (A. Gustafson, 1945 - 1950).

Taistelu kemiallisen suojan tehokkuuden lisäämisestä edelleen, tehokkaampien estäjien etsiminen ja eston periaatteet ovat edelleen biofysiikan päätehtäviä tähän suuntaan.

Biopolymeerien virittyneiden tilojen, jotka määräävät niiden korkean kemiallisen aktiivisuuden, tutkimuksessa on edistytty. Menestynein oli fotobiologisten prosessien - fotosynteesin ja näön - primäärivaiheessa syntyvien kiihtyneiden tilojen tutkimus.

Siten on annettu vankka panos kasvien pigmenttijärjestelmien molekyylien ensisijaisen aktivoitumisen ymmärtämiseen. Kiihtyneiden tilojen energian siirron (migraatio) ilman hävikkiä aktivoiduista pigmenteistä muihin substraatteihin on osoitettu. Tärkeä rooli näiden ajatusten kehittämisessä oli A. N. Tereninin teoreettisilla teoksilla (1947 ja myöhemmin). A. A. Krasnovsky (1949) löysi ja tutki klorofyllin ja sen analogien palautuvan fotokemiallisen pelkistyksen reaktion. Nykyään ollaan yleisesti sitä mieltä, että lähitulevaisuudessa fotosynteesi on mahdollista toistaa keinotekoisissa olosuhteissa (katso myös luku 5).

Biofyysikot jatkavat työtä lihasten supistumisen ja mekanismien luonteen paljastamiseksi hermostunut jännitys ja käyttäytyminen (katso luku 11). Myös viritystilasta normaalitilaan siirtymisen mekanismien tutkimuksesta on tullut ajankohtaista. Kiihtynyttä tilaa pidetään nyt autokatalyyttisen reaktion tuloksena, ja eston katsotaan olevan seurausta estävän antioksidanttiaktiivisuuden voimakkaasta mobilisaatiosta, joka johtuu molekyylien uudelleenjärjestelyistä yhdisteissä, kuten tokoferolissa (I. I. Ivanov, O. R. Kols, 1966; O. R. Kols, 1970).

Biofysiikan tärkein yleinen ongelma on edelleen tieto elävän aineen laadullisista fysikaalisista ja kemiallisista ominaisuuksista. Ominaisuudet, kuten elävien biopolymeerien kyky sitoa selektiivisesti kaliumia tai polarisoida sähköä, ei voi säilyä edes huolellisimmalla kehosta poistamalla. Siksi solujen biofysiikka jatkaa intensiivistä kriteerien ja menetelmien kehittämistä elävän aineen elinikäiseen tutkimukseen.

Molekyylibiologian nuoruudesta huolimatta sen edistyminen tällä alalla on todella hämmästyttävää. Suhteellisen lyhyessä ajassa geenin luonne ja sen järjestäytymisen, lisääntymisen ja toiminnan perusperiaatteet on selvitetty. Lisäksi ei ole suoritettu vain geenien in vitro -lisäystä, vaan myös ensimmäistä kertaa itse geenin täydellinen synteesi on saatu päätökseen. Geneettinen koodi on täysin purettu ja tärkein biologinen ongelma proteiinien biosynteesin spesifisyydestä on ratkaistu. Tärkeimmät solun proteiininmuodostuksen tavat ja mekanismit on tunnistettu ja tutkittu. Monen perusrakenne kuljetus-RNA- spesifiset adapterimolekyylit, jotka kääntävät nukleiinimallien kielen syntetisoidun proteiinin aminohapposekvenssin kieleksi. Monien proteiinien aminohapposekvenssi on täysin selvitetty ja joidenkin niiden tilarakenne on selvitetty. Tämä mahdollisti entsyymimolekyylien toiminnan periaatteen ja yksityiskohtien selvittämisen. Yhden entsyymin, ribonukleaasin, kemiallinen synteesi suoritettiin. Erilaisten subsellulaaristen hiukkasten, monien virusten ja faagien järjestäytymisen perusperiaatteet on selvitetty ja niiden pääasialliset biogeneesit solussa on selvitetty. On löydetty lähestymistapoja geenitoiminnan säätelytapojen ymmärtämiseen ja vitaalitoiminnan säätelymekanismien selvittämiseen. Jo yksinkertainen luettelo näistä löydöistä osoittaa, että 1900-luvun jälkipuoliskolla. leimasi valtava edistys biologiassa, mikä johtuu ensisijaisesti biologisesti tärkeiden makromolekyylien - nukleiinihappojen ja proteiinien - rakenteen ja toiminnan perusteellisesta tutkimuksesta.

Molekyylibiologian saavutuksia käytetään käytännössä jo tänään ja ne tuovat konkreettisia tuloksia lääketieteessä, maataloudessa ja joillakin toimialoilla. Ei ole epäilystäkään siitä, että tämän tieteen paluu lisääntyy joka päivä. Päätuloksena on kuitenkin pidettävä sitä, että molekyylibiologian menestysten vaikutuksesta luottamus rajattomien mahdollisuuksien olemassaoloon matkalla elämän salaisimpien salaisuuksien paljastamiseen on vahvistunut.

Tulevaisuudessa ilmeisesti avautuu uusia tapoja tutkia aineen liikkeen biologista muotoa - biologia siirtyy molekyylitasolta atomitasolle. Nyt ei kuitenkaan ehkä ole yhtäkään tutkijaa, joka voisi realistisesti ennustaa molekyylibiologian kehitystä edes seuraavien 20 vuoden aikana.

haastatella

Pirogov Sergey - osallistuja "Norsun ja kirahvin" järjestämän biologian olympialaisten valmisteluun vuonna 2012.
Kansainvälisen biologian Universiadin voittaja
Olympian "Lomonosov" voittaja
Alueellisen vaiheen voittaja Koko Venäjän olympialaiset biologiassa vuonna 2012
Opiskelu Moskovan valtionyliopistossa. M.V. Lomonosov Biologian tiedekunnassa: Molekyylibiologian laitos, 6. vuoden opiskelija. Työskentelee molekyyligenetiikan instituutin eläinten biokemiallisen genetiikan laboratoriossa.

- Seryozha, jos lukijoilla on kysyttävää, voivatko he kysyä sinulta?

Kyllä, voit tietysti esittää kysymyksiä ainakin välittömästi. Tällä alalla:

Napsauta tätä esittääksesi kysymyksen.

- Aloitetaan koulusta, eikö sinulla ollut superhieno koulu?

Opiskelin erittäin heikolla Moskovan koulussa, sellaisessa keskivertokoulussa. Totta, meillä oli upea opettaja Moskovan taideteatterissa, jonka ansiosta meillä oli suurelta osin nimellinen koulun "taidehistoriallinen" suunta.

- Entä biologia?

Biologian opettajamme oli hyvin iäkäs, kuuro ja terävä nainen, jota kaikki pelkäsivät. Mutta rakkaus aiheeseensa ei lisännyt. Olen ollut intohimoisesti biologiasta lapsesta asti, viisivuotiaasta lähtien. Luen itse kaiken, lähinnä anatomia ja eläintiede. Niin koulutarvikkeet olemassa rinnakkain omien etujeni kanssa. Olympialaiset muuttivat kaiken.

- Kerro minulle lisää siitä.

7. luokalla osallistuin ensimmäistä kertaa kunnalliseen vaiheeseen (tietysti melkein kaikissa aineissa kerralla, koska olin ainoa oppilas, jonka opettajilla oli syytä lähettää). Ja hän voitti biologiassa. Sitten koulu piti tätä hauskana, mutta ei kovin mielenkiintoisena tosiasiana.

- Auttoiko se sinua koulussa?

Muistan, että loistavista opiskeluistani huolimatta sain usein biologian opettajalta B:n näppylällä kuten "sipulin osan piirustuksessa juuret tulee maalata ruskeiksi, ei harmaiksi." Kaikki oli aika masentavaa. Kahdeksannella luokalla menin jälleen olympialaisiin, mutta jostain syystä minua ei lähetetty biologiaan. Mutta hänestä tuli voittaja ja palkinnon voittaja muissa aiheissa.

- Mitä tapahtui 9. luokalla?

9. luokalla en mennyt piirivaiheeseen. Siellä sain yllättäen heikon, raja-arvosanan, joka kuitenkin osoittautui aluevaiheelle siirtymiseksi. Sillä oli voimakas motivoiva voima - ymmärrys siitä, kuinka paljon en tiedä ja kuinka moni tietää kaiken tämän (kuinka monta tällaista ihmistä valtakunnallisessa mittakaavassa pelkäsin edes kuvitella).

- Kerro meille, kuinka valmistauduit.

Intensiivinen itseopiskelu, kirjakauppojen tutkailut ja tuhannet viime vuoden tehtävät vaikuttivat parantavasti. Sain yhden teorian korkeimmista pisteistä (joka oli myös minulle täysin odottamaton), menin käytännön vaiheeseen ... ja epäonnistuin. Tuolloin en edes tiennyt käytännön vaiheen olemassaolosta.

- Vaikuttiko olympialaiset sinuun?

Elämäni on muuttunut radikaalisti. Opin monista muista olympialaisista, erityisesti rakastuin SBO:hen. Myöhemmin hän näytti monia hyvät tulokset, jotkut voittivat, kiitos "Lomonosovskaya" sai oikeuden tulla ilman kokeita. Samaan aikaan voitin taidehistorian olympialaisia, joihin hengitän edelleen epätasaisesti. Totta, hän ei ollut ystävä käytännön matkojen kanssa. 11. luokalla pääsin kuitenkin loppuvaiheeseen, mutta Fortune ei ollut suotuisa, enkä tällä kertaa ehtinyt täyttää teoreettisen vaiheen vastausmatriisia. Mutta tämä mahdollisti sen, että käytännöllisyydestä ei tarvinnut huolehtia liikaa.

- Oletko tavannut monia olympialaisia?

Kyllä, olen edelleen sitä mieltä, että minulla oli erittäin onnekas ikätovereideni kanssa, jotka laajensivat suuresti näköalojani. Olympialaisten toinen puoli, motivaation lisäksi opiskella aihetta harmonisemmin, oli tutustuminen olympialaisiin. Huomasin jo tuolloin, että horisontaalinen kommunikaatio on joskus hyödyllisempää kuin vertikaalinen kommunikointi - opettajien kanssa harjoitusleirillä.

- Miten pääsit yliopistoon? Valitsitko tiedekunnan?

11. luokan jälkeen astuin Moskovan valtionyliopiston biologian tiedekuntaan. Vain suurin osa silloisista tovereistani teki valinnan FBB:n hyväksi, mutta tässä päärooli oli sillä, että minusta ei tullut All-Russianin voittajaa. Joten minun piti suorittaa sisäinen koe matematiikasta, ja siinä, varsinkin koulussa - rakastuin ylempään paljon enemmän - en ollut vahva. Ja koulussa oli erittäin huono valmistautuminen (emme olleet edes valmistautuneet melkein koko C-osaan). Kiinnostuksen suhteen arvelin jo silloin, että lopulta voit päästä mihin tahansa tulokseen sisäänpääsypaikasta riippumatta. Myöhemmin kävi ilmi, että monet FBB:stä valmistuneet ovat siirtyneet pääosin märkäbiologiaan ja päinvastoin - monet hyvät bioinformaatikot aloittivat amatöörinä. Vaikka sillä hetkellä minusta tuntui, että biologisen tiedekunnan osasto olisi erilainen kuin FBBshny. Tässä olin varmasti väärässä.

Tiesitkö?

Mielenkiintoista

Tiesitkö?

Mielenkiintoista

Elefantti ja kirahvi -leirillä on vuoroja biokemiassa ja molekyylibiologiassa, jossa koululaiset yhdessä Moskovan valtionyliopiston kokeneiden opettajien kanssa perustavat kokeita ja valmistautuvat olympialaisiin.

© Haastatteli Reshetov Denis. Valokuvat tarjosi ystävällisesti Sergei Pirogov.

Molekyylibiologia, tiede, joka asettaa tehtäväkseen elämänilmiöiden luonteen tuntemisen tutkimalla biologisia esineitä ja järjestelmiä molekyylitasoa lähestyvällä tasolla ja joissain tapauksissa saavuttaen tämän rajan. Perimmäisenä tavoitteena tässä tapauksessa on selvittää, miten ja missä määrin elämän luonteenomaiset ilmenemismuodot, kuten perinnöllisyys, omanlaisensa lisääntyminen, proteiinien biosynteesi, kiihtyvyys, kasvu ja kehitys, tiedon varastointi ja välittäminen, energiamuunnos, liikkuvuus, jne., johtuvat biologisesti tärkeiden aineiden molekyylien rakenteesta, ominaisuuksista ja vuorovaikutuksesta, pääasiassa kahdesta suurimolekyylisten biopolymeerien pääluokasta - proteiineista ja nukleiinihapoista. Erottava piirre M. b. - elämän ilmiöiden tutkimus elottomilla esineillä tai sellaisilla, joille on ominaista elämän primitiivisimmät ilmentymät. Nämä ovat biologiset muodostelmat solutasolta ja sen alapuolelta: subsellulaariset organellit, kuten eristetyt soluytimet, mitokondriot, ribosomit, kromosomit, solukalvot; lisäksi - elävän ja elottoman luonnon rajalla seisovat järjestelmät - virukset, mukaan lukien bakteriofagit, ja päättyen elävän aineen tärkeimpien komponenttien - nukleiinihappojen ja proteiinien - molekyyleihin.

Perustan, jolle M. kehittyi, loivat sellaiset tieteet kuin genetiikka, biokemia, alkuaineprosessien fysiologia jne. Kehityksensä alkuperän mukaan M. b. liittyy erottamattomasti molekyyligenetiikka, joka on edelleen tärkeä osa

Erottava piirre M. b. on sen kolmiulotteisuus. M. b.:n olemus. M. Perutz näkee sen tulkitseessaan biologisia toimintoja molekyylirakenteen kannalta. M. b. pyrkii saamaan vastauksia kysymykseen "miten", tietäen molekyylin koko rakenteen roolin ja osallistumisen olemuksen, sekä kysymyksiin "miksi" ja "miksi" saatuaan toisaalta selville suhteen molekyylin (jälleen ensisijaisesti proteiinit ja nukleiinihapot) ominaisuuksien ja sen suorittamien toimintojen välillä ja toisaalta tällaisten yksittäisten toimintojen roolin kokonaisessa elintärkeän toiminnan ilmentymien kompleksissa.

Avainsaavutukset molekyylibiologia. Tässä on kaikkea muuta kuin täydellinen luettelo näistä saavutuksista: DNA:n, kaikentyyppisten RNA- ja ribosomien rakenteen ja biologisen toiminnan mekanismin paljastaminen, geneettisen koodin paljastaminen; käänteistranskription, ts. DNA-synteesin löytäminen RNA-templaatissa; hengitysteiden pigmenttien toimintamekanismien tutkimus; kolmiulotteisen rakenteen ja sen toiminnallisen roolin löytäminen entsyymien toiminnassa, matriisisynteesin periaate ja proteiinien biosynteesin mekanismit; virusten rakenteen ja niiden replikaation mekanismien paljastaminen, vasta-aineiden primaarinen ja osittain avaruudellinen rakenne; yksittäisten geenien eristäminen, kemiallinen ja sitten biologinen (entsymaattinen) geenisynteesi, mukaan lukien ihminen, solun ulkopuolella (in vitro); geenien siirto organismista toiseen, myös ihmissoluihin; kasvavan määrän yksittäisten proteiinien, pääasiassa entsyymien, sekä nukleiinihappojen, nopeasti etenevä kemiallisen rakenteen purkaminen; joidenkin jatkuvasti monimutkaisempien biologisten objektien "itsekokoontumisilmiöiden" löytäminen alkaen nukleiinihappomolekyyleistä ja siirtymällä monikomponenttisiin entsyymeihin, viruksiin, ribosomeihin jne.; allosteeristen ja muiden biologisten toimintojen ja prosessien säätelyn perusperiaatteiden selvittäminen.

Molekyylibiologian ongelmat. Mainittujen tärkeiden tehtävien lisäksi M. tekisi. ("tunnistuksen", itsekokoamisen ja integraation lakien tuntemus) tieteellisen etsinnän varsinainen suunta lähitulevaisuudessa on sellaisten menetelmien kehittäminen, jotka mahdollistavat rakenteen purkamisen ja sitten kolmiulotteisen, tilaorganisaation korkean molekyylitason nukleiinihapot. Fyysikot ehdottivat ja kehittivät kaikki tärkeimmät menetelmät, joiden käyttö takasi M. b:n syntymisen ja menestyksen (ultrasentrifugointi, röntgendiffraktioanalyysi, elektronimikroskopia, ydinmagneettinen resonanssi jne.). Lähes kaikki uudet fysikaaliset kokeelliset lähestymistavat (esim. tietokoneiden käyttö, synkrotroni tai bremsstrahlung, säteily, lasertekniikka ja muut) avaavat uusia mahdollisuuksia M. b.:n ongelmien syvälliseen tutkimiseen. Joukossa kriittisiä tehtäviä luonteeltaan käytännöllinen, johon vastausta odotetaan M. b:ltä, ensinnäkin pahanlaatuisen kasvun molekyyliperustan ongelma, sitten - keinot ehkäistä ja ehkä voittaa perinnölliset sairaudet- Molekyylisairaudet. Suuri merkitys tulee olemaan biologisen katalyysin molekyyliperustan eli entsyymien toiminnan selvittäminen. Tärkeimpiä moderneja suuntauksia M. b. tulee sisältää halu selvittää hormonien, myrkyllisten ja lääkeaineiden molekyylien toimintamekanismit sekä selvittää tällaisten solurakenteiden molekyylirakenteen ja toiminnan yksityiskohdat, kuten biologiset kalvot osallistuvat aineiden tunkeutumisen ja kuljetuksen säätelyyn. Kauemmat maalit M. b. - tuntemus hermostoprosessien luonteesta, muistin mekanismeista jne. Yksi tärkeimmistä nousevista osioista M. b. - niin sanottu. geenitekniikka, joka asettaa tehtäväkseen elävien organismien geenilaitteiston (genomin) määrätietoisen toiminnan, alkaen mikrobista ja alemmasta (yksisoluisesta) ja päättyen ihmiseen (jälkimmäisessä tapauksessa ensisijaisesti elävien organismien radikaalia hoitoa varten). perinnölliset sairaudet ja geneettisten vikojen korjaaminen).

MB:n tärkeimmät ohjeet:

– Molekyyligenetiikka– solun geneettisen laitteen rakenteellisen ja toiminnallisen organisaation sekä perinnöllisen tiedon toteutusmekanismin tutkimus

– Molekyylivirologia – virusten ja solujen vuorovaikutuksen molekyylimekanismien tutkimus

– Molekyyliimmunologia – elimistön immuunireaktiomallien tutkimus

– Kehityksen molekyylibiologia – tutkimus solujen heterogeenisyyden esiintymisestä aikana yksilöllistä kehitystä eliöt ja solujen erikoisalat

Tärkeimmät tutkimuskohteet: Virukset (mukaan lukien bakteriofagit), Solut ja subsellulaariset rakenteet, Makromolekyylit, Monisoluiset organismit.