Metode de cercetare în histologie. Pregătirea preparatelor pentru microscopie. Metode de laborator pentru studiul celulelor și țesuturilor Metode utilizate în histologie și embriologie

Metodele moderne pentru studiul țesuturilor și celulelor folosesc realizările fizicii, chimiei, biochimiei, biologie moleculara, Inginerie genetică. Acest lucru a devenit posibil datorită creării de noi instrumente și tehnologii - diverse tipuri de microscoape, tehnologie computerizată, analiză prin difracție de raze X, autoradiografie, electroforeză și cromatografie, separarea și cultivarea celulelor, obținerea de hibrizi și hibridoame etc. Cu toate acestea, în ciuda acestor metode diverse, histologie în La bază, este o știință morfologică, ale cărei obiecte de studiu sunt celulele și țesuturile vii și fixe.

Principalele metode de studiere a structurii animalelor și celule vegetale iar tesuturile este microscopie cu lumina. Microscoapele moderne oferă o rezoluție (capacitatea de a observa două puncte separat) de ordinul a 0,2 microni și oferă o mărire maximă de 2000-2500 de ori. Pentru contrast, microobiectele sunt colorate după fixare. Fixarea se reduce la fixarea structurii intravitale a obiectului studiat.

Agenții de fixare includ formol (5-20%), alcool etilic, acid osmic.

Colorarea se realizează prin diferite metode în funcție de obiectivele studiului.

Microscopia cu lumină include contrastul de fază, fluorescența, ultravioleta, interferența și microscopia în câmp întunecat.

Microscopie cu contrast de fază folosit pentru a studia obiecte vii transparente incolore (celule și țesuturi). Această metodă asigură contrastul structurilor necolorate aflate în studiu datorită unei diafragme inelare speciale plasate în condensator și a unei plăci de fază amplasate în obiectiv. Ca rezultat, toate structurile care diferă ca indice de refracție devin vizibile într-o imagine alb-negru.

Microscopie fluorescentă (luminiscentă).În timpul fluorescenței, atomii și moleculele unui număr de substanțe, care absorb razele cu lungime de undă scurtă, trec într-o stare excitată. Trecerea inversă la starea normală are loc odată cu emisia de lumină, dar cu o lungime de undă mai mare.

Medicamentul este văzut în raze ultraviolete sau violete și albastre.

Distingeți între fluorescența proprie sau primară și indusă sau secundară. Serotonina, catecolaminele (adrenalină, noradrenalina) conținute în celulele nervoase, catarg și alte celule au fluorescență primară după fixarea țesuturilor în vapori de formaldehidă la 60-80ºС.

Fluorescența secundară este cauzată de coloranți speciali - fluorocromi (acrino-portocaliu, rodamină, fluorocină etc.). De exemplu, atunci când medicamentele sunt tratate cu portocaliu acrin, ADN-ul din celulă are o strălucire verde strălucitor, iar ARN-ul are o strălucire roșie aprinsă.

microscopie ultravioletă bazat pe utilizarea razelor ultraviolete scurte cu o lungime de undă de aproximativ 0,2 microni. Distanța admisă în acest caz este de 0,1 µm. Imaginea este înregistrată pe o placă fotografică sau pe un ecran fluorescent.

Microscopie în câmp întunecat. Se folosește un condensator special, care luminează preparatul cu lumină strict oblică; razele de la iluminator sunt direcționate din lateral. Obiectul observat apare ca iluminat într-un câmp întunecat. Această metodă este folosită pentru a observa obiectele vii, pentru a studia cristalele din urină.

microscopie de interferență. Un microscop de interferență este utilizat pentru a cuantifica masa țesutului, iar un microscop de interferență diferențială (cu optica Nomarsky) este folosit pentru a studia relieful suprafeței celulei.

Într-un microscop de interferență, fasciculul de lumină de la iluminator este împărțit în două fluxuri: unul trece prin obiect, celălalt ocolește obiectul. În prismele obiectivului, ambele fascicule sunt conectate și interferează între ele. În acest caz, secțiunile micro-obiectului de diferite grosimi și densități diferă în gradul de contrast. După cuantificarea modificărilor se determină concentrația și masa de substanță uscată. Avantajul microscopiei cu contrast de fază, interferență și câmp întunecat este capacitatea de a observa celulele în procesul de mișcare și diviziune (mitoză, meioză).

Microscopia polarizante este o modificare a unui microscop cu lumină în care sunt instalate două filtre polarizante: unul (polarizator) între fascicul de lumină și obiect, iar al doilea (analizator) între lentila obiectiv și ochi. Ambele filtre se pot roti, schimba direcția fasciculului de lumină.

În acest caz, proprietatea unor structuri organice de a refracta lumina polarizată de-a lungul diferitelor axe optice în moduri diferite se manifestă datorită orientării speciale a moleculelor lor (anizotropie). De exemplu, fibrele de colagen și miofibrilele apar ca luminoase atunci când axa de rotație a filtrelor se modifică.

Microscopia electronică. Microscopul electronic folosește un flux de electroni în vid cu lungimi de undă mai scurte decât un microscop cu lumină. La o tensiune de 50000V, lungimea de undă oscilații electromagnetice egal cu 0,0056 nm.

Se calculează teoretic că distanța rezolvabilă în aceste condiții poate fi de 0,002 nm, adică. De 100.000 de ori mai mic decât într-un microscop cu lumină. Cu toate acestea, în practică este de 0,1-0,7 nm. În prezent, microscoapele electronice cu transmisie (transmisie) (TEM) și microscoapele electronice cu scanare (scanare) (SEM) sunt utilizate în studiile histologice. Microscoapele electronice cu transmisie fac posibilă obținerea doar a unei imagini plane a microobiectului studiat, în timp ce microscoapele electronice cu scanare sunt capabile să creeze o imagine tridimensională, de exemplu. sondarea secvenţială a punctelor individuale ale suprafeţei cu un fascicul de electroni.

Imaginea rezultată este afișată pe un ecran de televiziune, al cărui fascicul de electroni se mișcă sincron cu microsonda.

Pentru a studia detaliile structurii membranelor și a contactelor intercelulare, se utilizează metoda de congelare - ciobire (-160ºС). Metoda microscopiei electronice „înghețare” - gravarea este utilizată pentru a studia suprafața exterioară a membranelor celulare. După congelare, blocul este spart de cristale de gheață, îndepărtate prin sublimarea apei în vid. Apoi, o peliculă subțire de metal greu (de exemplu, platină) este pulverizată pe celule.

Metodele de înghețare fac posibilă studierea celulelor nefixate fără formarea de artefacte în ele cauzate de fixator.

Microscopie de ultraînaltă tensiune. Microscoapele electronice cu tensiune de accelerare de până la 3.000.000 V fac posibilă studierea obiectelor de grosimi mari (1-10 µm).

Pentru a studia structura macromoleculelor la nivel atomic, se folosesc metode care folosesc raze X cu o lungime de undă de aproximativ 0,1 nm (diametrul atomului de hidrogen).

Metode de cercetare histologică

sunt folosite pentru a studia structura și funcția celulelor și țesuturilor oamenilor, animalelor și plantelor în condiții normale, patologice și experimentale. Baza lui G. m. și. este - un ansamblu de tehnici metodologice utilizate la fabricarea preparatelor de celule și țesuturi pentru examinarea microscopică a acestora. Studiul microscopic al celulelor și țesuturilor poate fi efectuat în două moduri principale, în funcție de starea obiectului studiat: studiul celulelor și țesuturilor vii, studiul celulelor și țesuturilor nevii care își păstrează structura datorită fixării speciale. tehnici.

Studiul obiectelor vii - vitale (supravitale) - face posibilă observarea proceselor fiziologice din celule și țesuturi, structura lor intravitală. Se efectuează pe celule suspendate liber într-un mediu lichid (celule sanguine, celule epiteliale de răzuire etc.), precum și pe culturi de celule și țesuturi crescute pe medii nutritive speciale. Obiectul observării intravitale poate fi filme subțiri, transparente de țesut (, membrană de înot). ÎN studii experimentale se folosește metoda ferestrelor biologice (implantarea camerelor transparente) și studiul implanturilor tisulare într-un mediu natural transparent, de exemplu, în camera anterioară a ochiului animalelor. În funcție de sarcina la îndemână, diferite metode speciale de microscopie sunt utilizate în studiile vitale: câmp întunecat, contrast de fază, fluorescență, polarizare, ultraviolete. Metodele histologice vitale sunt utilizate în principal pentru cercetarea biologică și biomedicală. Utilizarea lor pe scară largă este limitată de mari dificultăți tehnice asociate cu proprietățile țesuturilor supraviețuitoare. ÎN cercetare medicala, în special în practica laboratoarelor de patologie și anatomie, se folosesc metode de studiere a obiectelor fixe.

Scopul fixării este de a păstra structura intravitală a celulelor și țesuturilor prin expunerea rapidă a acestora la agenți chimici care împiedică dezvoltarea modificărilor post-mortem. Alegerea metodei de fixare depinde de obiectivele studiului și de caracteristicile materialului de fixat. Astfel, pentru identificarea structurilor celulare subțiri se folosesc amestecuri de fixare care conțin săruri ale metalelor grele (de exemplu, sublimat).Cel mai bun fixativ în scopuri citologice este tetroxidul de osmiu, care este adesea folosit în microscopia electronică. Un fixativ universal este formaldehida, folosită sub formă de soluție de formol 10%. Pentru a fi uniforme și complete, bucățile de țesut trebuie să fie mici, iar volumul lichidului de fixare trebuie să fie de multe ori mai mare decât volumul materialului de fixat. După fixare, piesele sunt de obicei spălate în apă sau alcool. Componentele țesuturilor solide (de exemplu, depozitele de calciu) sunt îndepărtate folosind tehnici de decalcifiere.

Cel mai rapid și într-un mod simplu prepararea unei secțiuni de țesut, utilizată de obicei în diagnosticul expres, este o bucată și obținerea de secțiuni de țesut pe un microtom de congelare. Cu toate acestea, este dificil să se obțină secțiuni suficient de subțiri, precum și secțiuni din obiecte mici și țesuturi în descompunere. Prin urmare, bucăți de țesut, de regulă, sunt turnate în medii de etanșare - sau celoidină. Fixatul este deshidratat în alcooli cu putere crescătoare, trecut printr-un solvent intermediar (xilen sau pentru parafină, alcool-eter pentru celoidină) și impregnat cu parafină sau celoidină. în parafină vă permite să obțineți secțiuni mai subțiri (de la 5-8 la 1-2 micron) decât celoidina. Secțiunile pentru examinarea microscopică sunt pregătite folosind o lamă sau microtom rotativ. Secțiuni ultra-subțiri (grosime de la 90-100 la 5-15 nm) necesare pentru studiile microscopice electronice sunt pregătite pe un ultratom. Ultratomele sunt, de asemenea, folosite în microscopia cu lumină pentru a obține secțiuni semisubțiri. Secțiunile pregătite sunt colorate pentru a evidenția clar structurile celulelor și țesuturilor care percep coloranții în mod diferit. Coloranții de bază - baze de colorare și sărurile acestora (, albastru de toluidină, azur, maro bismarck) - colorează așa-numitele structuri bazofile (nuclei celulari, țesut conjunctiv). Coloranți acizi - acizi coloranți și sărurile acestora (acid picric, eritrozină) - colorează structurile acidofile sau oxifile (citoplasmă celulară, colagen, fibre elastice). colorarea ar trebui să se distingă prin impregnare - o metodă specială bazată pe anumite zone ale celulelor și țesuturilor pentru a restabili metalele grele (de exemplu, argint, aur, osmiu) din sărurile lor și, prin urmare, să dobândească o culoare intensă.

Pregătirea unui preparat histologic se finalizează prin plasarea acestuia în medii care asigură păstrarea structurilor obiectului, a culorii și a transparenței acestuia. Cel mai adesea, rășinile organice sunt folosite în aceste scopuri, de exemplu.

1. Mică enciclopedie medicală. - M.: Enciclopedia Medicală. 1991-96 2. Primul ajutor. - M.: Marea Enciclopedie Rusă. 1994 3. Dicţionar enciclopedic termeni medicali. - M.: Enciclopedia Sovietică. - 1982-1984.

Vedeți ce sunt „Metode de cercetare histologică” în alte dicționare:

Abordări metodice și metode de cercetare în anatomia umană- Uneori se aude că nu mai e nimic de studiat în anatomie, cercetare, se presupune că toate subiectele au fost epuizate, tot ce putea fi studiat a fost deja studiat, toate problemele au fost rezolvate. Ca și cum tot ceea ce privește structura corpului uman, ...... Glosar de termeni și concepte despre anatomia umană

CERCETARE DE LABORATOR- CERCETARE DE LABORATOR. vezi STUDII DE LABORATOR. Cea mai importantă condiție pentru obținerea unor rezultate de cercetare fiabile este alegerea corectă a obiectelor de analiză, selectarea lor în timp util și formularea problemei de cercetare. Reguli de eșantionare... Bolile peștilor: un manual

I Medicină Medicina este un sistem de cunoștințe și practici științifice care vizează întărirea și menținerea sănătății, prelungirea vieții oamenilor și prevenirea și tratarea bolilor umane. Pentru a îndeplini aceste sarcini, M. studiază structura și ...... Enciclopedia medicală

Modalități de a studia diferite obiecte folosind un microscop. În biologie și medicină, aceste metode fac posibilă studierea structurii obiectelor microscopice ale căror dimensiuni depășesc rezoluția ochiului uman. Baza lui M.m.i. constituie…… Enciclopedia medicală

- (celula histologică cytus + doctrina logos greacă) se bazează pe studiul caracteristicilor structurale ale celulelor cu un microscop, compozitia celulara organe, țesuturi, fluide corporale ale oamenilor și animalelor în procese normale și patologice. C. și...... Enciclopedia medicală

I Histologie (tesut histos grecesc + predare logos) medical stiinta biologica, care studiază evoluția țesuturilor, dezvoltarea lor în organism (histogeneză), structura, funcțiile și interacțiunea la animalele pluricelulare și la om. Principalul subiect de studiu al lui G. ...... Enciclopedia medicală

I Vulva (vulva; pudendum femininum) organe genitale feminine externe (conform Nomenclaturii Anatomice Internaționale zona genitală feminină). Anatomie și fiziologie. Vulva (Fig. 1) este situată în afara oaselor pubiene ale pelvisului și atașată de acestea ... ... Enciclopedia medicală

Studiind modificările provocate în organism de diverse procese bolii, își propune, prin metodele sale inerente de cercetare, atât determinarea acestor procese patologice, cât și semnificația lor în raport cu tabloul clinic al bolii și al morții... ... Dicţionar Enciclopedic F.A. Brockhaus și I.A. Efron

I Biopsie (viață bios greacă + vedere opsis, percepție vizuală) prelevarea intravitală a țesuturilor, organelor sau suspensiilor celulare pentru examinare microscopică în scopuri de diagnostic, precum și pentru studiul dinamicii procesului patologic și influența ... ... Enciclopedia medicală

Știința care studiază țesuturile animalelor. Un țesut este un grup de celule care sunt similare ca formă, dimensiune și funcție și în produsele lor metabolice. La toate plantele și animalele, cu excepția celor mai primitive, corpul este format din țesuturi, ...... Enciclopedia Collier

- (din greacă ἱστός țesut și greacă λόγος cunoaștere, cuvânt, știință) o ramură a biologiei care studiază structura țesuturilor organismelor vii. Acest lucru se face de obicei prin disecția țesutului în straturi subțiri și folosind un microtom. Spre deosebire de anatomie, ... ... Wikipedia

Cărți

• Mielom multiplu și boli ale celulelor plasmatice, Ramasami Kartik, Lonial Sagar. Cartea prezintă principalele aspecte clinice ale mielomului multiplu și ale altor boli plasmatice. Sunt descrise studii de laborator, patogeneză, diagnostic și tratament. In secunda…

Metode de cercetare histologică. Histologia modernă are un arsenal larg de diferite metode de cercetare. Toate aceste metode sunt unite de cerința de a utiliza un dispozitiv special - un microscop și, prin urmare, toate sunt metode microscopice.

În funcție de starea obiectului studiat, aceste metode sunt împărțite în vii (sau supravitale), când sunt studiate celule vii, țesuturi, organe și chiar organisme întregi, și post-vitale, când sunt examinate obiecte fixe moarte.

Dezvoltarea metodei post-vitale, sau a metodei de realizare a unui preparat histologic permanent, a avut loc în paralel cu dezvoltarea științei histologiei însăși în a doua jumătate a secolului al XIX-lea. Se mai numește și metoda histologiei clasice. Această metodă, numită tehnică histologică sau microscopică, necesită o pregătire destul de complexă a obiectului de studiu. Acesta din urmă este subiectul redactării unor manuale speciale, destul de mari. Un student care începe să studieze histologia trebuie să se familiarizeze cu tehnicile de bază de realizare a preparatelor histologice pentru a înțelege mai bine aceste preparate și pentru a învăța să analizeze, „să citească”, deoarece este vorba de preparate histologice permanente care sunt utilizate pe scară largă atât în proces educațional cât şi în cercetarea ştiinţifică.

Prima etapă în fabricarea medicamentului este obținerea materialului. Deja în această etapă, precum și în toate cele ulterioare, ar trebui evitată vătămarea inutilă a obiectului. Prin urmare, atunci când tăiați o bucată de organ sau țesut, trebuie să luați foarfece ascuțite sau o lamă, nu strângeți țesutul cu penseta. Piesele sunt luate în dimensiuni mici - aproximativ 1 cm3 (de preferință 7x7x3 mm). Materialul trebuie să fie proaspăt și luat cât mai curând posibil după sacrificarea animalului de experiment sau moartea persoanei.

Următoarea etapă - fixarea materialului, se realizează prin scufundarea piesei luate în lichide de fixare. Scopul acestei etape este fixarea structurilor histologice și a macromoleculelor în locul și starea în care se aflau într-un obiect viu. Desigur, fixatorii provoacă anumite modificări ale stării intravitale a structurilor, dar este posibil să se minimizeze aceste modificări prin selectarea agenților speciali de fixare. Fixatorii sunt alcooli (etil, metil), soluții de formol, săruri ale metalelor grele, acizi (acetic, picric, osmic). Mai des, se folosesc diverse amestecuri complexe de fixare, inclusiv componentele numite în diferite proporții.

A treia etapă este deshidratarea materialului fix. Pentru a face acest lucru, utilizați alcooli de diferite concentrații, crescând treptat de la 50-70 la 100 de grade. Deshidratarea este necesară pentru următoarea etapă - compactarea obiectului, efectuată în parafină, celoidină, rășini sintetice. Marea majoritate a acestor substanțe nu se amestecă cu apă și, prin urmare, pentru a impregna materialul cu ele, este necesar să se îndepărteze cu grijă apa din țesătură și apoi să o impregneze cu xilen (toluen, benzen), adică o substanță. care dizolvă bine parafina și, de asemenea, se amestecă cu alcool etilic de 100 de grade. După impregnarea obiectului cu parafină lichidă la o temperatură de 55-56 ° C, se dă întărit la temperatura camereiîmpreună cu parafina în forme speciale. Așa se obține un bloc de parafină. Această procedură se numește umplere. Compactarea accelerată se realizează prin înghețarea bucăților de țesut cu gheață carbonică (dioxid de carbon) sau azot lichid, însă, structura obiectelor histologice studiate se păstrează în acest caz mai rău.

Densificarea materialului face posibilă realizarea de secțiuni subțiri (5-7 µm grosime), pivton (0,5-1 µm) din acesta, care sunt utilizate pentru microscopia luminoasă; secțiunile ultrasubțiri (0,05-0,2 µm) sunt utilizate pentru microscopia electronică. Secționarea se efectuează pe dispozitive speciale - microtome (pentru microscopie ușoară) și ultramicrotome (pentru microscopia electronică). Secțiunile subțiri, subțiri sau ultrasubțiri sunt transparente la razele de lumină sau la un fascicul de electroni și fac posibilă studierea lor la microscoape adecvate. Pentru a distinge detaliile structurale ale obiectului, dintre care majoritatea nu au un contrast natural, secțiunea rezultată trebuie colorată (pentru examinarea la microscop cu lumină) sau contrastată (pentru microscopia electronică).

În histologie, există multe metode de colorare a preparatelor și se folosesc multe colorări diferite în funcție de scopul studiului. Coloranții histologici după origine sunt împărțiți în vegetali, animale și sintetici (anilină). Un exemplu de coloranți vegetali este hematoxilina, obținută din scoarța de lemn de lemn care crește în America Centrală și carminul animal, care este obținut din insecte - coșenila. Marea majoritate a coloranților sunt sintetici - eozină, magenta, azur etc.

Cea mai importantă este clasificarea coloraţiilor histologice în funcţie de proprietăți chimice, deoarece se bazează pe o serie de concepte și termeni care vor fi întâlniți pe parcursul cursului. Deci, în funcție de proprietățile chimice, coloranții histologici sunt împărțiți în acizi, bazici și neutri. Proprietățile coloranților acizi sunt specificate de grupele -COOH, -HS03, -H2P03, acestea sunt așa-numiții coloranți anionici. Coloranții acizi colorează citoplasma celulei, se numesc citoplasmatici. Un exemplu de astfel de coloranți poate fi eozina (oferă o culoare roz strălucitoare), verde deschis (dă Culoarea verde). Structurile histologice care pot fi colorate cu coloranți acizi sunt numite oxifile (acidofile, eozinofile). Acestea sunt, de exemplu, granule citoplasmatice ale leucocitelor eozinofile, fibre de colagen etc.

Coloranții principali sunt cationici, marea majoritate a acestora din compoziția moleculei trebuie să aibă atomi de azot încărcați pozitiv. Acești coloranți colorează selectiv nucleii celulelor și, prin urmare, sunt numiți nucleari. Un exemplu este hematoxilina (culori albastru-violet), carmin (roșu deschis), safranina (roșu închis), azur II (albastru). Structurile histologice care pot fi colorate cu coloranți bazici sunt numite bazofile. Acestea sunt granule din citoplasma leucocitelor bazofile, nucleelor ​​celulare etc.

Se formează coloranți neutri în caz de mesaj solutii apoase coloranți acizi și bazici, de exemplu, albastru de metilen acid eozin. În plus, ar trebui să se facă distincția între amestecurile de colorare neutre, atunci când coloranții bazici și acizi sunt prezenți simultan în soluție. Structurile care percep simultan atât coloranții bazici, cât și acizi sunt numite neutroprofile sau policromatofile. Un exemplu sunt granulele de leucocite neutrofile, citoplasma eritroblastelor policromatofile etc. Capacitatea structurilor histologice de a schimba culoarea colorantului principal este desemnată prin termenul metacromazie. Colorează metacromatice granularitatea leucocitelor bazofile, substanța intercelulară a țesutului cartilajului etc. Preparatele sunt de obicei colorate prin combinarea unui colorant acid și unul bazic, ceea ce face posibilă dezvăluirea nucleului, citoplasmei și a tuturor structurilor bazofile și oxifile. Unul dintre coloranții combinați cel mai frecvent este hematoxilina și eozina.

Pe lângă coloranții acizi, bazici și neutri, există și alții speciali folosiți pentru identificarea anumitor substanțe sau structuri. De exemplu, Sudan III colorează substanțele grase în portocaliu, iar orceina colorează fibrele elastice cu maro.

Preparatele colorate sunt de obicei deshidratate în alcooli, limpezite în xilen și acoperite cu un strat subțire de balsam canadian, acoperit cu o lamela. După ce balsamul se usucă, se obține un preparat permanent care poate fi folosit timp îndelungat. Pentru microscopia electronică, secțiunile obținute pe ultramicrotoame sunt așezate pe grile speciale, contrastate cu sărurile de uraniu sau plumb, vizualizate la microscop și fotografiate. Microfotografiile obţinute fac obiectul de studiu concomitent cu preparatele histologice.

Pe lângă secțiunile subțiri descrise, există și alte tipuri de preparate histologice care sunt utilizate mult mai rar, doar în unele cazuri. Acestea includ frotiuri (sânge, măduvă osoasă, salivă etc.), amprentele (ficat, timus, mucoasa vezicii urinare), filme (țesut conjunctiv, pleura, peritoneu, pia mater), preparate totale (dezvoltarea embrionilor în stadiu incipient, celule sexuale) .

Metodele vii (pe durata vieții) de studiu a celulelor sau țesuturilor fac posibilă obținerea de informații despre modul în care procesele vitale au loc în ele, pentru a urmări mișcarea, diviziunea, creșterea, interacțiunea celulelor, reacția lor la acțiunea diferiților factori. Metodele de cercetare intravitala sunt o completare necesara la datele obtinute prin metoda histologiei clasice asupra structurii celulelor si tesuturilor. Studiile intravitale sunt efectuate într-un organism viu, adică in vivo. Pentru studiul celulelor vii se folosesc metode de colorare de felicitare și supravitale. Pentru a face acest lucru, utilizați coloranți speciali care nu sunt toxici pentru țesuturile vii. Cu o colorare de felicitare, colorantul este injectat în corpul unui animal viu și colorează selectiv anumite celule. Așa se examinează celulele sistemului macrofage sub condiția introducerii albastrului tripan sau carminului de litiu. Supravital-non-colorare este colorarea celulelor vii izolate dintr-un organism. Așa sunt detectați lizozomii (colorant roșu neutru), mitocondriile (verde Janus), reticulocitele din sânge (albastru-cresyl strălucitor).

Pentru studiile de felicitare sau supravitale, precum și post-vitale, obiectele histologice necolorate folosesc o serie de metode speciale de microscopie luminoasă - contrast de fază, câmp întunecat, fluorescență.

Metoda contrastului de fază asigură contrastul necesar structurilor necolorate studiate datorită unei diafragme inelare speciale plasate în condensator și a așa-numitei plăci de fază conținută în obiectiv. Acest design al opticii unui microscop cu lumină face posibilă convertirea schimbărilor de fază ale luminii care trece prin obiect în modificări de amplitudine, pe care ochiul le observă ca modificări ale luminozității.

Histologie(din greaca histes - stofa si logos - invatatura) in traducere inseamna "stiinta tesuturilor". Cu toate acestea, o astfel de definiție restrânge sfera acestei științe, deoarece metoda histologică studiază nu numai țesuturile, ci și celulele și structura fină a organelor. În plus, sarcina histologiei este de a elucida evoluția celulelor și țesuturilor, formarea și dezvoltarea lor în organism, studiul funcțiilor celulelor, țesuturilor, organelor și substanței intercelulare, în studiul regenerării tisulare, asigurând structura lor structurală. si integritate functionala.

În acest sens, histologia este de obicei împărțită în trei secțiuni: citologie, histologie generală și histologie privată (anatomie microscopică). După cum știți deja, citologia este știința celulei - unitatea elementară a structurii, funcționării și originii materiei vii. Sarcina histologiei generale este de a studia structura, dezvoltarea, funcționarea și originea țesuturilor. Histologia privată este studiul structurii microscopice și ultramicroscopice a organelor. Trebuie remarcat faptul că împărțirea de mai sus a histologiei în secțiuni este artificială, deoarece celulele formează țesuturi, țesuturile fac parte din organe, iar organele formează un organism.

Prin urmare, celulele, țesuturile și organele sunt părți ale întregului organism. Numai organismul în unitatea sa cu mediul extern are integritate, iar celulele, țesuturile și organele au o importanță subordonată. Cu toate acestea, trebuie să suportăm împărțirea histologiei în secțiuni. Este necesar, în primul rând, pentru comoditatea prezentării materialului. În plus, fiecare dintre secțiuni este concepută pentru a rezolva o anumită gamă de probleme.

Histologia nu se poate dezvolta fără legătură strânsă cu alte discipline biologice: anatomie, fiziologie, genetică etc. În plus, histologia este asociată și cu chimia și fizica, deoarece studiile histologice folosesc din ce în ce mai mult metode de cercetare fizico-chimică, diverse substanțe chimice(fixative, coloranți) și instrumente fizice (microscoape, microtome etc.).

Principala metodă de studiu a histologiei este microscopică, care constă în pregătirea specială a obiectelor și examinarea lor la microscop. Pregătirea constă în fixarea și colorarea obiectului cu unul sau altul colorant și realizarea de secțiuni subțiri cu studierea lor ulterioară la microscop. De asemenea, este posibil să se studieze structura fină a obiectelor histologice pe preparate vii. Cu toate acestea, studiul obiectului în stare de viață este foarte dificil. În primul rând, structurile histologice din lumina transmisă sunt incolore și aproape imposibil de distins la microscop, iar în al doilea rând, dimensiunile lor mari împiedică studiul lor la microscop. Toate acestea necesită studiul obiectelor fixe, adică. celule moarte tratate cu diverse substanţe care îi păstrează structura şi compoziție chimică. Fiecare dintre aceste metode are propriile sale avantaje și dezavantaje, ceea ce indică necesitatea de a le folosi pe ambele ca fiind complementare.

Tehnologie moderna deschide oportunități largi pentru studiul structurilor histologice într-o formă vie. Pe obiecte vii sunt studiate proprietăți fiziceși compoziția chimică a celulelor. Cu ajutorul unui micromanipulator, se pot efectua diverse operații asupra celulelor (înlăturarea structurilor intracelulare, transplantul unui nucleu de la o celulă la alta etc.).

Metode de cercetare în histologie includ prepararea preparatelor histologice și studiul lor cu ajutorul microscoapelor cu lumină sau electronică. Preparatele histologice sunt frotiuri, amprente de organe, preparate de peliculă, secțiuni subțiri de bucăți de organe, colorate cu unul sau altul colorant (se examinează și secțiunile native necolorate), așezate pe o lamă de sticlă, închise într-un balsam și acoperite cu o lamă subțire. .

Pentru fabricarea de pregătirea histologică după luarea materialului, este necesar să se fixeze într-unul sau altul fixativ (formalină, alcool, iar pentru microscopie electronică - în glutaraldehidă și tetroxid de osmiu). Acest lucru se face pentru a preveni procesele de autoliză și pentru a păstra structura organului, aproape de viață. Urmează etapele de deshidratare a unei bucăți de organ în alcooli de concentrație crescândă și în xilen pentru compactarea țesuturilor, ceea ce este necesar pentru realizarea secțiunilor subțiri. Pentru a da unei piese de organ o densitate și o omogenitate și mai mare, ceea ce asigură o tăiere de înaltă calitate, aceasta este turnată într-un mediu organic - parafină, celoidină (pentru microscopie ușoară) și rășini organice (epon, araldit, durkupan) - pentru microscopie electronică. examinare.

Există și fizice modalități de fixare a materialului, dintre care cea mai comună este înghețarea rapidă a unei bucăți de organ folosind azot lichid și alte mijloace. Pentru tăierea materialului congelat se folosesc dispozitive speciale - criostate sau microtomi de congelare.

Grosimea secțiunilor destinate luminii microscopie, nu trebuie să depășească 4-5 microni, pentru electronice - 50-60 nm (astfel de secțiuni ultrasubțiri sunt realizate pe un dispozitiv special ultratom folosind cuțite din sticlă sau diamant și modul de tăiere automată).

După ce a primit tăieturi acestea se așează pe lame de sticlă, urmate de etapele de eliberare a secțiunilor din mediul de încorporare (cu microscopie luminoasă) și colorare pentru a da contrast secțiunilor. Dintre colorațiile histologice, cea mai frecvent utilizată combinație de hematoxilină, care marchează nucleul (molecule acide) și eozină, care colorează selectiv. molecule proteice(colorare citoplasmatică).

După colorare, secțiunile se pune în medii de conservare (canadian, balsamuri de cedru) și se acoperă cu o lamela.

Principala metodă de examinare histologică celule, țesuturi și organe este microscopia cu lumină. Un microscop cu lumină folosește lumina vizibilă pentru a ilumina un obiect. Microscoapele ușoare moderne permit obținerea unei rezoluții de ordinul a 0,2 microni (rezoluția unui microscop este cea mai mică distanță la care două puncte adiacente sunt vizibile ca separate). Varietăți de microscopie luminoasă - contrast de fază, interferență, polarizare, câmp întunecat etc.

Microscopie cu contrast de fază- o metodă de studiere a celulelor într-un microscop cu lumină echipat cu un dispozitiv de contrast de fază. Datorită deplasării de fază a undelor luminoase într-un microscop cu acest design, contrastul structurilor obiectului studiat crește, ceea ce face posibilă studierea celulelor vii.

microscopie de interferență. Într-un microscop de interferență, fasciculele de lumină incidente asupra unui obiect sunt bifurcate - un fascicul trece prin obiect, celălalt trece pe lângă. Odată cu reunirea ulterioară a fasciculelor, apare o imagine de interferență a obiectului. Prin defazarea unui fascicul față de altul, se pot aprecia concentrațiile diferitelor substanțe din obiectul studiat.

Microscopia polarizante. La microscoapele de acest tip, fasciculul de lumină este descompus în două fascicule polarizate în planuri reciproc perpendiculare. Trecând prin structuri tisulare cu o orientare strictă a moleculelor, razele întârzie unele față de altele din cauza refracției lor inegale. Schimbarea de fază rezultată este un indicator al birefringenței structurilor celulare (în acest fel, de exemplu, au fost studiate miofibrilele).